細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)的建立及臨床應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、敗血癥(sepsis)是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性感染疾病,在新生兒中具有較高的死亡率,發(fā)病隱匿,臨床癥狀無特異性。因此,尋找一種快速、準(zhǔn)確的敗血癥早期診斷方法,對指導(dǎo)臨床治療、降低患兒死亡率、改善預(yù)后,具有十分重要的意義。目前,細(xì)菌培養(yǎng)是作為“金標(biāo)準(zhǔn)”在診斷臨床細(xì)菌性病原微生物標(biāo)本,然而該方法缺乏快速和敏感性。在本研究中,我們分析細(xì)菌16S rRNA基因序列,在其保守區(qū)設(shè)計通用引物和革蘭陰、陽性菌分型探針,建立了細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR新方法

2、,并對臨床的相關(guān)標(biāo)本進行了檢測。本研究分二部分:第一部分,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)的建立;第二部分,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)臨床應(yīng)用。 第一部分細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)的建立 方法:分析臨床常見菌16S rRNA基因序列,在高度保守區(qū)自行設(shè)計通用引物和革蘭陽性和陰性分型探針,建立細(xì)菌革蘭陰、陽性菌雙通道熒光定量PCR檢測體系,選取臨床較常見的53株臨床分離株(25株為革蘭陽性菌、28株為革蘭陰性菌)進行

3、細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法檢測,以評價該方法探針的特異性;以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別代表革蘭陽性和陰性菌進行濃度梯度稀釋,稀釋品進行該方法的檢測以評價細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR的敏感度和線性關(guān)系。 結(jié)果:細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR具有較好的敏感性和特異性,最低能檢測到3個金黃色葡萄球菌,而大腸桿菌可以檢測低到1個細(xì)菌數(shù)。53株臨床培養(yǎng)分離株進行該方法檢測:25株革蘭陽性菌株通過革蘭陽性探針(FAM-G+探針)檢測均為陽

4、性,28株革蘭陰性菌株通過革蘭陰性探針(VIC-G-探針)檢測均為陽性,反之均為陰性,符合率100%。巨細(xì)胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隱球菌及白色念珠菌,人基因組DNA及空白對照均為陰性。 結(jié)論:建立了用通用引物和分型雙熒光探針的細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法。其檢測快速、準(zhǔn)確,具有較大的臨床推廣應(yīng)用和臨床指導(dǎo)用藥價值。 第二部分細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)臨床應(yīng)用 方法:用建立的細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR

5、方法對1000例臨床疑似為敗血癥的患兒血標(biāo)本和125份擬診為化膿性腦膜炎的腦脊液標(biāo)本,進行該方法的檢測,同時進行細(xì)菌培養(yǎng)對照實驗,檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果: 1.在1000例血標(biāo)本中,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR共檢出64例陽性標(biāo)本,其中革蘭陽性菌40例,革蘭陰性菌24例,陽性率為6.40%(64/1000);血培養(yǎng)共檢出50例陽性,陽性率為5.00%(50/1000),陽性率前者高于后者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.

6、01)。 2.在125份腦脊液標(biāo)本中,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR共檢出17份陽性,其中革蘭陽性菌為10份,革蘭陰性菌為7份,陽性率為13.6%(17/125);腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)共檢出6份陽性,陽性率為4.8%(6/125);陽性率前者顯著高于后者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 3.以細(xì)菌培養(yǎng)為對照,對血標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本進行匯總,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR的檢測敏感度為91.07%,特異性為97.36%,約登指數(shù)為0.

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