2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  建立一種快速、敏感、特異的五重?zé)晒舛縍T-PCR方法檢測甲型流感的不同亞型,并對(duì)2010~2013年杭州地區(qū)甲型流感H3N2進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查,通過選擇壓力分析為疫苗研制提供依據(jù)。
  方法:
  1.設(shè)計(jì)甲型禽流感病毒基質(zhì)蛋白(M)區(qū)、H3、H5、H7及內(nèi)參基因(RNaseP,RP)的引物及Taqman探針,并對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系中,五套引物及探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化。
  2.合成各基因標(biāo)準(zhǔn)品片段

2、,將其連接到質(zhì)粒載體PmdTM19-T Simple Vector上進(jìn)行轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)。經(jīng)鑒定后提取質(zhì)粒DNA,利用NanoDrop ND-2000核酸檢測儀測量質(zhì)粒DNA的濃度,確定DNA的拷貝數(shù)作為敏感度的標(biāo)準(zhǔn)品定量母液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,將標(biāo)準(zhǔn)品定量母液稀釋至所需最高濃度(107copies/mL),并連續(xù)10倍稀釋至最低濃度(102copies/mL),然后用本方法和WHO推薦的方法進(jìn)行靈敏度比較。
  3.在本方法的反應(yīng)體系中加

3、入其它18種呼吸道病原微生物[乙型流感病毒,禽流感H5N3、H5N1、H9N2病毒,人副流感病毒Ⅰ~Ⅲ型,呼吸道合胞病毒A和B型,肺炎支原體,銅綠假單胞菌,肺炎克雷伯菌,鮑曼不動(dòng)桿菌,金黃色葡萄球菌,白念珠菌]提取的模板,檢測反應(yīng)體系的特異性。
  4.將確定好的各質(zhì)粒DNA濃度,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,稀釋至所需要的濃度(106copies/mL),連續(xù)三次10倍稀釋至(104copies/mL),用本方法分別檢測三次,檢測反應(yīng)體系的(批

4、內(nèi))重復(fù)性,并與WHO推薦方法的結(jié)果進(jìn)行比較。
  5.用本方法對(duì)262例疑似患者與正常人的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測,并與上海之江生物有限公司生產(chǎn)的市售試劑盒的方法結(jié)果比較。
  6.2010年1月至2013年12月浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)相關(guān)數(shù)據(jù),分別采用研究試劑所有病例的咽拭子均進(jìn)行H3N2流感病毒檢測,并經(jīng)過血凝抑制實(shí)驗(yàn)和流感病毒核酸監(jiān)測證實(shí)。
  7.病原學(xué)檢測:樣本先進(jìn)行流感病毒核酸檢測,采用五重RT-PCR

5、檢測試劑盒。
  8.序列收集:所有H3N2的HA(hemagglutinin)與NA(neuraminidase)基因完整序列均在NCBI上搜索查找獲取,搜索關(guān)鍵詞分別為:“China”,“Hangzhou”,“Hong Kong”加“H3N2 HA gene complete cds”,“H3N2 NA gene complete cds”,香港地區(qū)H3N2基因序列并入中國整個(gè)國家序列中。
  9.HA與NA基因序列篩選

6、與比對(duì):依據(jù)病毒的分離地、時(shí)間、宿主為前提條件進(jìn)行整合,條件相同序列只取一條。H3N2基因序列按照地區(qū)分為中國HA(133)、杭州HA(69)和杭州NA(69)三組。
  10.分子鐘與人口感染動(dòng)力學(xué)分析:利用jModeltest軟件找出序列最適堿基替換模型,按照手冊(cè)中要求參數(shù)設(shè)置(http://code.google.com/p/jmodeltest2)。再使用Beast軟件中貝葉斯MCMC(Bayesian Markov ch

7、ain Monte Carlo)法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行堿基替換速率、最近共同祖先(Time of most recent common ancestor, TMRCA)和Skyline plot分析,依據(jù)操作手冊(cè)中要求的參數(shù)(http://beast.bio.ed.ac.uk/Tutorials/)進(jìn)行設(shè)置,我們建立一個(gè)嚴(yán)格分子鐘的指數(shù)生長模型,通過Tracer軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析,并規(guī)定有效樣本大?。‥SS)>200,最終計(jì)算分子鐘(堿基替

8、換速率)與時(shí)間人口感染動(dòng)力學(xué)關(guān)系圖,用Beast軟件包中TreeAnnotator程序,計(jì)算獲最大可信樹(MCCT,),用FigTree對(duì)所得到的樹進(jìn)行編輯,獲得H3N2病毒的HA基因在時(shí)間標(biāo)尺與地理位置上的進(jìn)化圖。
  11.甲型流感病毒H3N2選擇壓力分析:選擇壓力(dN-dS)可以反映病毒在收到外界環(huán)境進(jìn)行選擇時(shí)的進(jìn)化情況,其中,dN(non-synonymous substitutions)代表非同義突變率,dS(syno

9、nymous substitutions)表示同義突變率。選擇壓力計(jì)算時(shí)以密碼子發(fā)生非同義突變率dN與同義突變率dS的差值來確定選擇的方向性,中性選擇(dN=dS,dN-dS=0),正向選擇(dN-dS>0),凈化選擇(負(fù)向選擇,dN-dS<0)。
  12.與選擇壓力(正向選擇)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá):在PDB數(shù)據(jù)庫中找出與H3N2基因密碼子相似程度較高(>30%)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),以此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,比較各選擇壓力位點(diǎn)下的蛋白質(zhì)

10、結(jié)構(gòu)的變化。分別在蛋白質(zhì)空間三維結(jié)構(gòu)圖中進(jìn)行標(biāo)記。
  結(jié)果:
  1.引物與探針的設(shè)計(jì)與濃度優(yōu)化:引物與探針濃度采用矩陣法進(jìn)行,以獲得的Ct值較小而熒光強(qiáng)度最大的濃度為反應(yīng)體系最合適濃度。
  2.五重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系的靈敏度:五重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)在檢測甲型禽流感病毒基質(zhì)蛋白(M)區(qū)、H3、H5、H7及RNase P的合成片段時(shí),各自靈敏度與WHO推薦的方法一致,均達(dá)到了在102copies/mL

11、時(shí)能擴(kuò)增出條帶。
  3.五重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系的特異性:將上述18種呼吸道病原菌的核酸提取物作為模板分別加入多重?zé)晒舛縍T-PCR進(jìn)行測定,除流感病毒出現(xiàn)很好的陽性結(jié)果外,其它所有病毒的檢測結(jié)果均呈陰性。特異性達(dá)到了100%。
  4.五重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系的重復(fù)性(批內(nèi)):不同濃度核酸各自的檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.193~0.451之間,變異系數(shù)(CV)最高達(dá)1.999%,本方法具有較好的批內(nèi)重復(fù)性。

12、
  5.五重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系的檢測符合率:使用本方法與已有試劑對(duì)臨床262例疑似患者和正常人的痰液標(biāo)本應(yīng)用多重?zé)晒舛縍T-PCR方法進(jìn)行檢測。
  6.2010~2013年杭州地區(qū)H3N2感染率分析,不同年度間H3N2感染率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=14.004,P<0.05),不同性別和年齡組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.552,x2=2.691,P>0.05)。
  7.我國流行甲型流感病毒H3N2

13、的HA基因堿基替換速率為1.6584×10-3(95%可信區(qū)間:1.5325×10-3~1.7988×10-3),TMRCA:1945年(95%可信區(qū)間:1940~1952年),人口感染規(guī)模評(píng)價(jià)出現(xiàn)了兩次高峰且感染率總趨勢呈現(xiàn)上升狀態(tài)。
  8.通過SLA法計(jì)算可得到陽性選擇位點(diǎn)4個(gè),14,153,209,278。陰性位點(diǎn)有238個(gè)。
  結(jié)論:
  1.多重?zé)晒舛縍T-PCR技術(shù)是利用TaqMan技術(shù)在普通PCR原

14、有的一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加了一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。利用該探針能與病原核酸特異性結(jié)合,而且結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域,探針的5'端和3'端分別標(biāo)記不同的熒光素,在PCR擴(kuò)增過程中,利用檢測系統(tǒng)中熒光量的變化,通過檢測儀檢測并記錄熒光信號(hào)的變化判定檢測結(jié)果,我們利用此原理建立了多重?zé)晒釸T-PCR法檢測不同的流感亞型。
  2.檢測方法的評(píng)價(jià):通過標(biāo)準(zhǔn)毒株與臨床樣本的檢測比較,發(fā)現(xiàn)我們建立的多重?zé)晒釸T-PCR特異性和靈敏度均達(dá)

15、到了WHO推薦方法的特異性和靈敏度水平,而且我們的方法更快速,簡便,并只需一次反應(yīng)可同時(shí)檢測甲型禽流感病毒和H3、H5、H7不同甲型禽流感不同亞型。
  3.臨床標(biāo)本驗(yàn)證:通過分別使用我們?cè)噭┡c之江在售試劑,同時(shí)檢測臨床病人與正常人標(biāo)本后,我們得出兩者符合率達(dá)到了100%。
  4.通過對(duì)該方法的多角度評(píng)價(jià),可知該方法具有快速、穩(wěn)定、靈敏度和特異性高、重復(fù)性好的特點(diǎn),對(duì)于臨床上檢測流感病毒及其不同亞型具有一定的意義。

16、  5.我們推測2012年后的H3N2病毒株可能是其他省份病毒遷徒所致;2013年病毒株HA與NA基因序列,均處于2012年病毒株樹分支的下級(jí),我們推斷2013年的病毒株為2012年病毒株復(fù)蘇后感染再傳播,2012年H3N2病毒株感染后,使部分感染人群產(chǎn)生獲得免疫,對(duì)于此病毒株再次感染具有一定的保護(hù)作用,致使2013年杭州地區(qū)H3N2病毒流感樣人群中感染率下降。
  6.H3N2基因堿基置換速率為1.6525×10-3(95%可信

17、區(qū)間:1.4796×10-3~1.8287×10-3),要明顯低于H1N1(7.06×10-3,95%可信區(qū)間:5.4×10-3~8.8×10-3)、H5N1(8.87×10-3,95%可信區(qū)間:7.0×10-3~10.72×10-3)等高致病性禽流感的堿基置換速率,這也是H3N2在我國流行的感染病毒株,多以低變異株為主的主要原因。由堿基置換速率我們推測H3N2病毒H3基因的產(chǎn)生時(shí)間:1945年(95%可信區(qū)間:1940~1952年),

18、由于H3N2病毒存在一組未在人類感染的病毒進(jìn)化分支,因此剔除未感染人病毒組,計(jì)算人感染H3N2的H3基因產(chǎn)生時(shí)間為:1960年(95%可信區(qū)間:1957~1962年)與實(shí)際H3N2流行發(fā)生時(shí)間相符。同時(shí)H3N2病毒在我國感染的規(guī)模與時(shí)間的分布出現(xiàn)了兩次高峰且感染率總趨勢呈現(xiàn)上升狀態(tài)。
  7.可將HA1基因的153(137)位于A抗原區(qū),209(193)位于B抗原區(qū),278(262)位于E抗原區(qū),作為研制H3N2流感疫苗的依據(jù),在

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