空腸彎曲菌快速檢測(cè)方法建立和應(yīng)用的研究.pdf

1、空腸彎曲茵(Campylobacter jejuni)是近年越來(lái)越受到發(fā)達(dá)國(guó)家重視的食源性致病微生物，所引起的急性腹瀉發(fā)病數(shù)呈較快上升趨勢(shì)。隨著近年我國(guó)城鎮(zhèn)居民物質(zhì)生活水平的快速提高，各種禽肉類和奶類食品在膳食中所占比例不斷加大，因食用被空腸彎曲茵污染的食物而導(dǎo)致的急性腹瀉也越來(lái)越多。傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法在檢測(cè)空腸彎曲茵時(shí)存在諸多不足或缺陷，為了探索并建立檢測(cè)空腸彎曲菌的快速檢測(cè)方法，初步開(kāi)展江蘇地區(qū)的空腸彎曲菌污染狀況的監(jiān)測(cè)。

2、本文建立了快速檢測(cè)鑒別食品中的空腸彎曲菌的Multiplex PCR方法，并推廣應(yīng)用于日常檢測(cè)，初步了解南京地區(qū)市售禽肉類食品中空腸彎曲菌的污染狀況。根據(jù)Gene bank中所載空腸彎曲菌hipO、mapA、23S rRNA等基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6引物輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了多對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證篩選出最佳引物組合，然后對(duì)引物濃度、Mg<'2+>濃度、退火溫度、dLNTP濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化

3、，最終建立從食品中快速檢測(cè)鑒別空腸彎曲茵的Multiplex PCR方法。 1.經(jīng)過(guò)多次采用空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株、結(jié)腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株及其它常見(jiàn)腸道致病菌標(biāo)準(zhǔn)株的特異性試驗(yàn)，證明本Multiplex PCR方法的特異性較強(qiáng)，僅在空腸彎曲菌可同時(shí)擴(kuò)增出3條特異性片段，在結(jié)腸彎曲菌時(shí)僅可擴(kuò)增出1條彎曲茵屬的特異性片段，而在其它各種腸道致病菌均無(wú)任何片段擴(kuò)出。 2.經(jīng)過(guò)多次采用空腸彎曲茵標(biāo)準(zhǔn)株10<'-3>、10<'-4>、10<'-

4、5>、10<'-6>、10<'-7>、10<'-8>罐的梯度稀釋菌液同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增，證明本Multiplex PCR方法的檢測(cè)靈敏度在15CFU左右，優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法的45CFU。 3.從2005年9月份至2006年6月份，在食源性致病菌污染狀況的日常監(jiān)測(cè)中，從南京市區(qū)各菜場(chǎng)共采得各種禽肉類樣品290份，然后分別用空腸彎曲菌國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法和Multiplex PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方

5、法共檢出空腸彎曲菌48株，污染率為16.6％；Multiplex PCR方法共檢出空腸彎曲菌110株，污染率為37.9％。再次證明了Multiplex PCR方法檢測(cè)空腸彎曲菌的靈敏度和結(jié)果均優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。 研究結(jié)論：Multiplex PCR方法用于檢測(cè)食品中的空腸彎曲茵時(shí)檢測(cè)周期短，靈敏度高，特異度好，操作簡(jiǎn)便易于推廣，且對(duì)檢測(cè)儀器要求不高，可以作為進(jìn)一步開(kāi)展食品中空腸彎曲菌污染狀況的監(jiān)測(cè)和控制的技術(shù)基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)對(duì)食品中空