弧菌和彎曲菌資料

1、弧菌和彎曲菌,醫(yī)學檢驗系臨床微生物及免疫學教研室井申榮,第一部分 弧 菌,概 述,弧菌科（Vibrionaseae）包括一群氧化酶陽性、具有端極鞭毛、動力陽性的細菌，有4個菌屬，其中，弧菌屬是一群氧化酶陽性，發(fā)酵葡萄糖，對弧菌抑制劑O/129（二氨基二異丙基喋啶）敏感的細菌。弧菌屬(Vibrio)廣泛分布于自然界，尤以水中為多，有100多種。主要致病菌為霍亂弧菌和副溶血弧菌（致病性嗜鹽菌）。前者引起霍亂；后者引起食物中毒。

2、,霍 亂 弧 菌,霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫的烈性傳染病。,霍亂弧菌包括兩個生物型：古典生物型（Classical biotype）和埃爾托生物型（EL-Tor bio-type）。這兩種型別除個別生物學性狀稍有不同外，形態(tài)和免疫學性基本相同，在臨床病理及流行病學特征上沒有本質(zhì)的差別。自1

3、817年以來，全球共發(fā)生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第七次病原是埃爾托型所致。,1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集。該菌株在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株。,一、生物學性狀（一）形態(tài)染色,霍亂弧菌呈弧形或逗點形態(tài)，大小為1.4~2.6&

4、#215;0.5~0.8μm。革蘭氏陰性菌，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細菌運動極為活潑，呈流星穿梭運動。,圖注：霍亂弧菌的鞭毛（↑）和它可溶解的鞘膜（↑↑） 負染，×3 100,圖注：分裂中的霍亂弧菌 冰凍蝕刻，×70 000,,（二）培養(yǎng)特性,霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌;營養(yǎng)要求不高，耐堿不耐酸，在pH8.8～9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因其

5、他細菌在這一pH不易生長，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養(yǎng)基;在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，透明。,常用的選擇培養(yǎng)基為硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS），霍亂弧菌在其中可形成較大的菌落，因發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸而使菌落呈黃色。,,,（三）生化反應,兩個生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。遲緩發(fā)酵乳糖，不分解阿拉伯糖。氧化酶、明膠酶試驗均陽性。能產(chǎn)生靛基質(zhì)，霍亂紅反

6、應陽性,El Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應有所不同,El Tor型V－P試驗為陽性，能產(chǎn)生強烈的溶血素，溶解羊紅細胞，在血平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)，古典型試驗V－P試驗為陰性，不溶解羊紅細胞。個別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。,（四）抗原性 1．抗原結構：,2．分群和分型：,根據(jù)O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成139個血清群。根據(jù)是否與O1抗血清凝集分兩大群， 凡能與O1群抗血清發(fā)生凝集的稱

7、為O1群霍亂弧菌； 凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群統(tǒng)稱為非O1群霍亂弧菌。,血清型：O1群霍亂弧菌的菌體抗原由A、B、C三個抗原成份組成,生物型：O1群霍亂弧菌有古典生物型和E1 Tor 生物型之分，兩個生物型具有相同的血清型。我國流行以El Tor、小川型霍亂弧菌為主。噬菌體分型： 對噬菌體的敏感性進行分型，其中較為實用的是第Ⅳ組和第Ⅴ組噬菌體。,＋　９０％以上為陽性；－　９０％以上為陰性；ｄ　１０－８９％陽性,（

8、五）變異性：,（六）抵抗力,霍亂弧菌古典生物型對外環(huán)境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強?；魜y弧菌對熱、干燥、日光、化學消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿而不耐酸?；魜y弧菌對鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素敏感，但El Tor生物型對一定濃度的多粘菌素B及慶大霉素有耐藥性。,二、致病性和免疫性1．致病物質(zhì),（1） 鞭毛、菌毛、粘液素酶（2） 霍亂腸毒素（cholera enterotoxin） 霍亂腸毒素

9、本質(zhì)是蛋白質(zhì)，不耐熱。對蛋白酶敏感而對胰蛋白酶抵抗。 該毒素屬外毒素，具有很強的抗原性。,致病機理,霍亂弧菌,,胃,,對酸敏感，很快被殺死,,腸,胃酸降低或缺乏，菌體增多,,鞭毛、菌毛、粘液素酶,絨毛上大量繁殖,,CT的B亞單位結合神經(jīng)節(jié)苷脂受體,,形成膜通道,,A1肽鏈進入細胞,,,ATP → cAMP↑,,腸粘膜上皮細胞分泌亢進,,腸液大量分泌,,大量體液和電解質(zhì)進入腸腔而發(fā)生劇烈吐瀉,,大量脫水和失鹽,發(fā)生

10、代謝性酸中毒，血循環(huán)衰竭，甚至休克或死亡,,激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng),2．所致疾病,引起烈性腸道傳染病的霍亂，為我國的法定傳染?。最悾憩F(xiàn)為劇烈的上吐下瀉，導致嚴重的脫水、酸中毒、痙攣、尿閉、休克和死亡。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染（糞口途徑）?；颊叱霈F(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”，并含大量弧菌，此為本病典型的特征。,3．免疫性,患過霍亂的人可獲得牢固的免疫力，再感染者少見。病后小腸

11、內(nèi)可出現(xiàn)分泌型lgA。,三、微生物學診斷,由于霍亂流行迅速，且在流行期間發(fā)病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對治療和預防本病的蔓延有重大意義。（一）標本采集： 標本以糞便為主，一般米泔水樣便采取1－3ml，成形便采取蠶豆大小。在某些情況下，亦可采取嘔吐物和尸體腸內(nèi)容物作檢材。,檢驗程序,（三）檢驗方法及鑒定1．直接鏡檢：,1）動力觀察：采取病人“米泔水樣”大便或嘔吐物制成懸滴片，觀察細菌動力，可見流星或穿梭

12、狀動力的細菌。2）制動試驗： 標本， 霍亂多價診斷血清（效價1：64），用暗視野鏡觀察，3分鐘內(nèi)運動被抑制的即為陽性， 此法優(yōu)點是快速而特異操作簡便，但必須有數(shù)量較多的弧菌才檢出。,3）涂片染色：　　革蘭氏染色陰性　　并成魚群狀排列的弧菌。,2．快速診斷：,1） 免疫熒光菌球法：將標本接種于含有霍亂弧菌熒光抗體的堿性蛋白胨水中，經(jīng)37℃4～6h，如有霍亂弧菌，在熒光顯微鏡下可見發(fā)熒光的菌球。本法適用于做大量標本的初

13、篩。2） SPA協(xié)同凝集試驗：以霍亂弧菌IgG型抗體與SPA陽性葡萄球菌結合作為試劑，與米泔水樣便或增菌液作玻片凝集，立即出現(xiàn)明顯凝集者（＋＋＋）為陽性。,3．細菌分離培養(yǎng)1） 直接分離培養(yǎng)：,分離用的培養(yǎng)基有強、弱2種選擇培養(yǎng)基。弱選擇培養(yǎng)基：堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂。強選擇培養(yǎng)基：常用的有慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和TCBS瓊脂等?，F(xiàn)多采用堿性蛋白胨水增菌，再用強選擇培養(yǎng)基進行分離。,4． 鑒定：,根據(jù)霍亂弧菌在各種選擇

14、培養(yǎng)基上的特點，挑選可疑菌落進行鑒定。鑒定以血清學（玻片凝集）為主，結合形態(tài)學、生化反應作出判斷。1） 玻片凝集試驗：從分離培養(yǎng)基上挑取可疑菌落于霍亂弧菌多價診斷血清作玻片凝集試驗。診斷血清應稀釋成1:32-1:64的效價使用，立即出現(xiàn)凝集者為陽性，同時設生理鹽水和陽性細菌株對照。,2） 形態(tài)學檢查：取純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)及染色性。用懸滴法或半固體穿刺法檢測動力。3） 生化反應：霍亂弧菌氧化酶試驗、靛基質(zhì)試驗、粘

15、絲試驗和霍亂紅試驗均陽性。 ①粘絲試驗：用于測定霍亂弧菌形成粘絲的特性。將0.5％去氧膽酸鈉水溶液于霍亂弧菌混勻制成濃厚菌液，1min內(nèi)懸液由混變清，并變得粘稠，以接種環(huán)挑取時可以拉出絲來?；魜y弧菌古典生物型和El Tor生物型均呈陽性。,② 霍亂紅試驗：出現(xiàn)薔薇色，為霍亂紅試驗陽性。由于霍亂弧菌和其他弧菌均有此種反應，故無特異性?！　。ɑ魜y弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，霍亂弧菌液能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，因此當霍亂弧

16、菌培養(yǎng)在含有硝酸鹽成分的蛋白胨水中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽可與吲哚結合成亞硝酸吲哚，滴加濃硫酸即可出現(xiàn)薔薇色，稱為霍亂紅試驗陽性）③ O/129敏感試驗：將O/129（2，4二氨基－6，7－二異丙基喋啶）藥敏紙片（10－150μg）貼在接種有待測菌的瓊脂平板上作紙片擴散試驗，凡藥物紙片周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)者為敏感。,4） 霍亂弧菌的分型鑒別試驗：①血清分型：用小川型和稻葉型單價診斷血清作玻片凝集。與小川型血清凝集而與稻葉型血清不凝集者為小川型

17、，反之為稻葉型。在兩個單價血清中均有明顯凝集者為彥島型。②生物型別的鑒定：目前，兩型主要依靠第Ⅳ組霍亂噬菌體裂解試驗進行鑒別，并輔以多粘菌素敏感試驗、雞紅細胞凝集試驗、V－P試驗和溶血試驗。,⒈ 第Ⅳ組霍亂噬菌體裂解試驗： 第Ⅳ組霍亂噬菌體常規(guī)稀釋液（106/ml）一般僅裂 解古典型，而不裂解El Tor型。⒉ 多粘菌素B敏感試驗： 取被檢菌2-3h肉湯培養(yǎng)物點種到含藥營養(yǎng)瓊脂平板上（多粘菌素B50U／

18、ml）,37℃培養(yǎng)24h，El Tor生物型生長，而古典型敏感。,,,⒊ 雞紅細胞凝集試驗：在玻片上滴加生理鹽水一滴，取被檢菌18-24h培養(yǎng)物少許在鹽水中制成濃厚菌懸液，然后加一滴2.5％雞紅細胞懸液，充分混勻，,1min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性，紅細胞呈均勻分散者為陰性。El Tor生物型為陽性，古典型為陰性。,鑒定要點：,確診O1群霍亂弧菌必須具備的條件：1、涂片為革蘭氏陰性弧菌或桿菌；2、TCBS等選擇培養(yǎng)基上典型的菌落特征；3

19、、動力陽性；4、O1群霍亂弧菌診斷血清凝集試驗陽性。,四、防治原則,必須貫徹預防為主。人群的菌苗預防接種，可獲良好效果，治療主要為及時補充液體和電解質(zhì)及應用抗菌藥物如四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素、強力霉素及氟哌酸類抗生素藥物。,第二部分 彎曲菌屬,彎曲菌屬(Campylobacter)細菌是一類微需氧、不分解糖類、氧化酶陽性、菌體彎曲呈逗點狀、S型或螺旋狀、有動力的革蘭氏陰性菌。對人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒亞種，前

20、者是人類腹瀉最常見的病原菌之一，后者在免疫功能低下時可引起敗血癥、腦膜炎等。本節(jié)主要以空腸彎曲菌介紹本屬的生物學特性和檢驗方法,一、生物學性狀,（一）形態(tài)與染色 空腸彎曲菌 （C.jejuni）菌體輕度彎曲似逗點狀，長1.5～5 μm，寬0.2～0.8 μm。菌體一端或兩端有鞭毛，運動活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。有莢膜，不形成芽胞。革蘭氏陰性。,圖注：空腸彎曲菌的兩端單鞭毛（↑） 負染，×2

21、1 000,（二）培養(yǎng)特性為微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2的環(huán)境中生長最好。最適溫度為37～42℃。在正常大氣或無氧環(huán)境中均不能生長。本菌營養(yǎng)要求高，需加入血液、血清才能生長。在凝固血清和血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時可見無色半透明毛玻璃樣小菌落，單個菌落呈中心凸起，周邊不規(guī)則，無溶血現(xiàn)象。,（三）生化反應空腸彎曲生化反應不活潑，不發(fā)酵糖類，不分解尿素，不液化明膠，靛基質(zhì)陰性?？蛇€原硝酸鹽，氧化酶和過氧化氫酶為陽性

22、。甲基紅和VP試驗陰性；枸椽酸鹽培養(yǎng)基中不生長。,（四）抵抗力抵抗力不強，易被干燥、直射日光及弱消毒劑所殺滅，56℃5分鐘可被殺死。對紅霉素、新霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年發(fā)現(xiàn)了不少耐藥菌株。,（五）抗原構造本菌抗原構造與腸道桿菌一樣具有O、H和K抗原。根據(jù)O抗原，可把空腸彎曲菌分成45個以上血清型。,二、致病性與免疫性,空腸彎曲菌是多種動物如牛、羊、狗及禽類的正常寄居菌。污染食物和飲水

23、，可引起人類急性腸炎和食物中毒，其致病因素與腸毒素、內(nèi)毒素、細胞毒素、侵襲力有關。感染后能產(chǎn)生特異性血清抗體，,三、微生物學診斷,（一）標本采集： 取腹瀉病人新鮮糞便或肛拭子立即送檢。如不能及時送檢，應將標本接種于卡－布運送培養(yǎng)基。（二）檢驗程序：,（三）檢驗方法及鑒定1．直接涂片 （1）懸滴標本檢查： 顯微鏡下觀察有無投鏢式或螺旋狀運動的細菌。腦脊液制成涂片作懸滴檢查。 （2）革蘭氏染

24、色檢查： 為革蘭氏陰性，逗點狀、S形或螺旋狀小桿菌。,,,,2．分離培養(yǎng)：選擇培養(yǎng)基分離 　　　接種于具有高度選擇性的平板培養(yǎng)（布氏菌血瓊脂抗性分離培養(yǎng)基），然后放玻璃缸內(nèi)（內(nèi)含85%N2，10%CO2，5%O2），置42℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。挑選可疑菌落，菌落為灰色、平坦、規(guī)則，在血平板上不溶血，再用生化反應和血清凝集試驗作出最后鑒定。,,,鑒定要點: 氧化酶陽性，革蘭氏陰性，菌體彎曲或稱S