空腸彎曲菌鞭毛輸出系統(tǒng)關(guān)鍵基因flhA突變株的構(gòu)建及其功能的初步研究.pdf

1、lS38356行的研究工作及取謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。工簽名：連墨壘日期：互!!呈：!!!翌關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以

2、將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。簽名：甚墨墨導(dǎo)師簽名：日期：塑墨摘要1_●_1口尸空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)為微需氧、無(wú)芽孢的革蘭氏陰性彎曲短桿菌，是全球范圍內(nèi)人類感染性腹瀉常見的食源性病原菌。鞭毛不僅是其運(yùn)動(dòng)器官，更是主要的毒力因子，在Cjejuni黏附、定

3、殖、侵入腸上皮細(xì)胞以及毒力蛋白分泌外輸過程中起重要作用。鞭毛輸出系統(tǒng)是鞭毛合成、裝配以及功能表現(xiàn)重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，大部分研究認(rèn)為鞭毛輸出系統(tǒng)與革蘭氏陰性細(xì)菌的Ⅲ型毒力蛋白分泌系統(tǒng)在進(jìn)化上是同源的，基因組分析以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究初步顯示，鞭毛輸出系統(tǒng)很可能承擔(dān)了CjejuniIII型毒力蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，與Cjejuni鞭毛致病性密切有關(guān)。為了深入探索鞭毛輸出系統(tǒng)與鞭毛合成以及致病性關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制，本課題運(yùn)用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了Cjejuni鞭

4、毛輸出系統(tǒng)關(guān)鍵基因flhA突變株(HXW001)，并初步研究了flhA在毒力和分子調(diào)控方面的功能。1、flhA插入失活突變株HXW001的構(gòu)建與鑒定本研究使用插入失活的方法構(gòu)建空腸彎曲菌flhA突變株，首先在EcoilJMl09中構(gòu)建敲除載體pMDl9TflhAkan“。其次，使用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入到空腸彎曲菌中，利用同源重組獲得突變株HXW001。2、突變株致病相關(guān)表型的初步研究主要包括生長(zhǎng)性能、運(yùn)動(dòng)能力、菌體結(jié)構(gòu)、自身凝集性(Au

5、toagglutination)、菌膜形成能力等，初步解析CjejuniflhA與毒力的相關(guān)性。結(jié)果表明，flhA的缺失，對(duì)菌體的生長(zhǎng)性能并無(wú)明顯影響，但是HXW001菌株的鞭毛缺失且喪失運(yùn)動(dòng)能力，生物膜形成能力和自身凝集現(xiàn)象明顯下降，說明flhA是鞭毛結(jié)構(gòu)和致病性重要的分子基礎(chǔ)。3、rThA對(duì)鞭毛合成調(diào)節(jié)功能的初步研究通過熒光定量PCR的方法研究了flhA對(duì)主要鞭毛絲蛋白基因tTaA、調(diào)節(jié)基因刀謝(o28)和rpoN(o54)在轉(zhuǎn)錄水

6、平上的調(diào)節(jié)功能，結(jié)果顯示，tTha的缺失降低了鞭毛結(jié)構(gòu)基因flea和鞭毛合成第三級(jí)調(diào)節(jié)基因∥謝的轉(zhuǎn)錄，對(duì)鞭毛合成第二級(jí)調(diào)節(jié)基因rpoN并無(wú)明顯的影響，表明，z枷不僅與鞭毛蛋白輸出有關(guān)，而且對(duì)鞭毛絲蛋白及其調(diào)節(jié)因子具有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控能力。4、tTha與ⅡI型毒力蛋白胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌相關(guān)性初步研究首先通過熒光定量PCR的方法研究J“flhA對(duì)Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果表明，17ha并不影響III型毒力蛋白基因cia