空腸彎曲菌感染人和雞體內(nèi)表達(dá)抗原的篩選及其生物學(xué)特性初步鑒定.pdf

1、ScreeningofinvivoinfectionrelatedantigensfromCampylobacterjejuni。humanandchickenhqcampylobacterlelUnlinUmanandChickenhostsand—analysisofbiologycharactersByYuanqingHuAdvisor：ProfJianpinTaoProfXinanJiaoADissertationSubmitt

2、edtoYangzhouUniversityInPartialFufillmentoftheRequirementfortheDoctorDegreeinPreventiveVeterinaryMedicineCompletedinNovember2012CommencementinDecember20122揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文首先選擇與細(xì)菌黏附、定植、入侵、外毒素和脂多糖合成等相關(guān)的27個(gè)毒力基因?yàn)闄z測(cè)靶基因，然后參考已公布的空腸彎曲

3、菌NCTC11168標(biāo)準(zhǔn)株全基因組序列，分別設(shè)計(jì)特異性PCR引物，最后分別對(duì)人源株和雞源株進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示：雞源空腸彎曲菌分離株中，黏附相關(guān)基因peblA和cadF的陽(yáng)性率較高，分別為100％和97％；定植因子中陽(yáng)性率最高的是eheY，雞分離株為100％，人分離株為92％；入侵相關(guān)基因中，雞源株的分布陽(yáng)性率均小于90％，最小的為virBll(97％)；人源株的陽(yáng)性率最高為92％(iamA)，最低的virBll僅為5％；外毒素相關(guān)

4、基因cdtA、cdtB和cdtC在人源株與雞源株間并無(wú)明顯差異，均以cdtB為最高，分別是97％和94％；脂多糖合成相關(guān)基因wlaN、waaF、neuBll檢出率在人源和雞源空腸彎曲菌的分離株中均不高。人源和雞源空腸彎曲菌分離株中毒力基因的分布總體沒(méi)有明顯差異，但不同功能基因略有不同，人源株中入侵和脂多糖合成相關(guān)的基因分布較高。本部分對(duì)空腸彎曲菌已知毒力基因在人和雞源分離株中的分布分析，有助于為體內(nèi)毒力基因的篩選提供參考。2空腸彎曲菌全

5、基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定空腸彎曲菌是一種重要的人獸共患病原菌，雞是其主要的貯存宿主，人感染后多表現(xiàn)為自限性胃腸炎。本研究旨在構(gòu)建空腸彎曲菌NCTC11168株的基因組表達(dá)文庫(kù)，為研究空腸彎曲菌體內(nèi)表達(dá)抗原及其致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。首先將該菌的基因組DNA用Sau3AI部分酶切后，切膠回收大d400“3000bp的片段。然后用BamHI酶切原核表達(dá)pET30a(b，c)系列載體，用SAP去磷酸化后，切膠回收線性質(zhì)粒載體。接著將回收的基因組D

6、NA片段與線性載體按10：1摩爾比例連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用載體特異性引物分析插入片段大小分布和插入正確率。然后從轉(zhuǎn)化的平板上刮菌提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE31的感受態(tài)細(xì)胞，獲得該菌的原核表達(dá)文庫(kù)。用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)入文庫(kù)質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌，SDSPAGE鑒定被誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)情況。最后確定該菌基因組表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵參數(shù)：用常規(guī)方法提取基因組，以05U／ggSau3AI在37℃部分酶切基因組30min

7、，片段集中于400“3000bp。載體用25U／pgBamHI線性化，后用08U／／tgSAP將其完全去磷酸化。按基因組片段與載體摩爾數(shù)10：1連接轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得了基因組表達(dá)文庫(kù)。結(jié)果顯示：庫(kù)容量達(dá)52700個(gè)克隆，其可以覆蓋空腸彎曲菌NCTC11168株的全基因組4次以上，片段插入正確率為833％917％，片段大小介于400一3000bp，且均勻分布，IPTG誘導(dǎo)體外表達(dá)文庫(kù)后蛋白呈現(xiàn)正確表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了空腸彎曲菌