空腸彎曲菌未知基因cj1199對紅霉素耐藥性和適應(yīng)性的功能研究.pdf

1、空腸彎曲菌是一種非常重要的食源性致病菌，是全球范圍內(nèi)感染性腹瀉常見的病原菌之一，同時也多種動物的共生菌。人類感染空腸彎曲菌的主要來源為被污染的水和動物性食品，如乳制品和未煮熟的肉類等。空腸彎曲菌感染常引起急性、自限性腸炎，也會導(dǎo)致全身感染甚至引起嚴重的并發(fā)癥一格林巴利綜合癥。一旦出現(xiàn)嚴重或持久感染，或免疫力低下者感染就需要使用抗生素進行治療。大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類是臨床常用的抗彎曲桿菌感染的藥物。近年來空場彎曲桿菌對氟喹諾酮類的耐藥問題

2、日益嚴重，使得大環(huán)內(nèi)酯類在治療感染時顯得尤為重要。其中紅霉素自上個世紀70年代開始應(yīng)用于腸道感染的治療，泰樂菌素作為畜禽專用抗生素被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。目前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，空腸彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥問題日益呈現(xiàn)，但是其機制尚未完全明確，適應(yīng)性相關(guān)研究也剛剛起步，這對控制耐藥的產(chǎn)生與傳播非常不利。本實驗室郝海紅博士對不同水平紅霉素耐藥的空腸彎曲菌NCTC11168和81-176進行芯片分析篩選耐藥菌中的差異表達基因。結(jié)果顯示在這兩種

3、細菌的差異基因中有5個未知功能的基因表達模式相同，其中cj1199的表達量在NCTC11168中隨耐藥性增高而增高。根據(jù)NCBI搜索到的該基因的核酸和氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析該基因是一種亞鐵依賴型氧化還原酶，結(jié)合郝海紅博士的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，我們推測該基因參與了細菌體內(nèi)氨基酸的合成以及細菌對外界環(huán)境的應(yīng)激從而輔助了細菌對紅霉素耐藥性和適應(yīng)性的產(chǎn)生。本研究選取cj1199為目的基因研究其功能及在空腸彎曲菌對紅霉素耐藥過程中所發(fā)揮的作用，為

4、防止耐藥性的產(chǎn)生和傳播提供理論指導(dǎo)和支撐，從而保障用藥的安全性和有效性。首先構(gòu)建載體，采用同源重組的方法構(gòu)建cj1199基因的缺失突變體；通過各種不同的表型實驗分析該基因缺失對細菌本身可能會造成的影響；通過基因芯片技術(shù)進行差異基因篩選，從而深入分析該基因的功能及對耐藥的影響。
　　 采取反向PCR和重疊延伸PCR兩種方法進行載體的構(gòu)建。反向PCR法要求先擴增cj1199及其上下游約2000 bp左右的基因片段，然后連接pGEM-

5、T easy載體。用分別攜帶BamH I和Sma I酶切位點的引物進行反向PCR擴增載體全長，同時用攜帶有相同酶切位點的引物擴增cat基因，將產(chǎn)物回收后用上述兩種酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，用T4 DNA lingase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)驗證無誤后擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。重疊延伸PCR法要求擴增攜帶有cat同源臂的cj1199上半段基因和下半段基因，然后將這兩個基因與cat進行重疊延伸，得到的基因片段連接pGEM-

6、T easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒。結(jié)果通過反向PCR法順利獲得目標載體。重疊延伸PCR法不成功。
　　 將構(gòu)建好的載體與NCTC11168混勻后共同孵育，進行自然轉(zhuǎn)化，將混合體系涂布于氯霉素抗性平板，篩選突變體。同時制備電轉(zhuǎn)化載體細胞，加入載體混勻，2450V、200Ω、25μF條件下持續(xù)電擊5 sec，加入預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，輕柔混勻，涂布含有氯霉素抗性的MH瓊脂平板，篩選突變體。結(jié)果顯示電轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化都成功獲得插

7、入缺失突變體，經(jīng)PCR及測序方法進行驗證無誤。
　　 以母源標準菌為對照組用基因芯片技術(shù)篩選缺失突變體中差異表達的基因。采用Real-time RT-PCR的方法對結(jié)果進行驗證。設(shè)置四組生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)SAM分析后總共篩選得到23個差異基因。其中2個基因上調(diào)表達，都與轉(zhuǎn)運相關(guān)；21個基因下調(diào)表達，有6個轉(zhuǎn)運相關(guān)基因，分別參與了天冬氨酸/谷氨酸以及鐵的轉(zhuǎn)運；5個氨基酸生物合成相關(guān)基因，參與了亮氨酸和色氨酸的生物合成；5個為細胞表面結(jié)

8、構(gòu)，其中有兩個與鐵刺激相關(guān)；2個假定蛋白，其余3個難以歸類。根據(jù)差異片段功能推測：cj1199基因影響了亮氨酸的生物合成，進而影響了抗性短肽的合成，對紅霉素用藥初期細菌的存活做出了貢獻，使得細菌產(chǎn)生主要耐藥機制的幾率增加；該基因還影響了天冬氨酸/谷氨酸的轉(zhuǎn)運，影響了細菌的能量及碳的供應(yīng)，對細菌在腸道內(nèi)的定殖和生長做出了貢獻。
　　 隨后進行了一系列的表型檢測。測定突變體的生長力、競爭生長力、在紅霉素中的競爭生長力以及在亮氨酸缺失

9、培養(yǎng)基中的生長力，與母源標準菌相比，突變體的生長力沒有明顯變化，但競爭生長力明顯下降，在紅霉素中的競爭生長力下降更為明顯。在亮氨酸缺失培養(yǎng)基中突變體的生長力明顯低于完全培養(yǎng)基中的生長力，也低于相同培養(yǎng)基中標準菌的生長力。測定突變體對不同藥物的耐藥性，發(fā)現(xiàn)兩種細菌沒有明顯區(qū)別：采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測紅霉素作用下突變體的通透性，發(fā)現(xiàn)高于母源標準菌的通透性，推測突變體對紅霉素的耐受性降低。用紅霉素誘導(dǎo)耐藥，發(fā)現(xiàn)突變體表現(xiàn)為較難誘導(dǎo)、較難

10、獲得高水平耐藥菌株。
　　 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了用于空腸彎曲菌基因敲除的載體，運用同源重組的方法成功構(gòu)建缺失突變體，并對突變體進行了差異基因的篩選和相關(guān)表型測試。突變體在各種競爭的環(huán)境中都表現(xiàn)出了較弱的競爭力，且細胞通透性增高，難以產(chǎn)生耐藥菌株。說明在臨床條件下突變體很快會被其他優(yōu)勢菌群替代，尤其是在紅霉素藥物作用情況下該菌株競爭生長處于弱勢的同時產(chǎn)生耐藥風(fēng)險也明顯降低。據(jù)差異基因功能推測，cj1199基因影響到了亮氨酸的