大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性對豬鏈球菌適應性的影響.pdf

1、豬鏈球菌作為重要的人畜共患病原菌，自報道以來已引起世界范圍的廣泛流行。最初大環(huán)內(nèi)酯類藥物能夠有效治療豬鏈球菌病，但目前豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥問題已較為嚴重。耐藥機制對宿主菌適應性的影響決定著細菌耐藥性的傳播速度，為有效控制大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豬鏈球菌的產(chǎn)生和流行，我們有必要對其耐藥性及適應性進行研究。本文分別研究了耐藥基因及靶位突變對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株適應性的影響，旨在為有效控制耐藥菌的擴散和流行提供理論依據(jù)。
　　一、耐藥基因mef

2、A/msrD對宿主菌的體外適應性影響
　　首先對攜帶mefA/msrD基因的耐藥菌株及相關(guān)參照敏感菌株進行生長曲線測定，并比較生長動力學參數(shù)，通過體外競爭試驗比較耐藥菌株與敏感菌株的相對適應性;而后通過構(gòu)建mefA相關(guān)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，探究mefA對宿主菌耐藥性及適應性的影響;最后利用pSET4s構(gòu)建溫敏性自殺重組質(zhì)粒，對耐藥豬鏈球菌NJ-2中的msrD基因進行定點無痕缺失，以期構(gòu)建msrD基因缺失突變株來研究msrD對

3、宿主菌適應性的影響。結(jié)果顯示體外競爭試驗測得攜帶外排泵的各耐藥菌株與親本株體外適應性無顯著差異;mefA基因成功轉(zhuǎn)化入DH5α后，其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的敏感性會下降，但未發(fā)現(xiàn)可檢測到的適應性代價;通過融合PCR方法將msrD基因的上下游同源臂連接在一起后，成功構(gòu)建得到同源重組質(zhì)粒pSET4s∷msrDL-msrDR。將該同源重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入受試菌株后，未能夠成功篩選到發(fā)生同源重組的陽性缺失菌株，推測可能是msrD基因?qū)κ茉嚲甑倪m應性起到關(guān)

4、鍵作用。
　　二、甲基化酶基因ermB對宿主菌的體外適應性影響
　　首先對臨床分離的豬鏈球菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株的適應性進行評價。PCR檢測受試菌株中的甲基化酶基因ermB，對攜帶ermB基因的耐藥菌株及參照敏感菌株進行了生長曲線的測定，并將計算得到的各耐藥菌株與敏感菌株的生長動力學參數(shù)進行比較;最后通過體外競爭試驗比較耐藥菌株與敏感菌株的相對適應性，而后構(gòu)建ermB耐藥基因相關(guān)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，初步探究ermB對宿主菌耐藥

5、性及適應性的影響。結(jié)果顯示:耐藥菌株HB1004、HB1010及SC05017相對兩株敏感菌株BA853和SS2-1的體外適應性差異均不顯著，但JS07002與兩株參照敏感菌株相比均表現(xiàn)為體外適應性較低。ermB基因在大腸桿菌中會顯著提高其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性，同時該基因會顯著降低宿主大腸桿菌的體外適應性。
　　三、藥物作用靶位突變對耐藥豬鏈球菌適應性的影響
　　挑選四株不同來源的大環(huán)內(nèi)酯類敏感豬鏈球菌作為研究對象，用紅

6、霉素、阿奇霉素及泰樂菌素分別對受試敏感菌株進行體外誘導耐藥;對獲得的高水平耐藥菌株的耐藥表型和基因突變型進行檢測;然后分析高水平耐藥菌的體外及體內(nèi)適應性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):誘導所得的所有高水平耐藥菌的23S rRNA都存在位點突變，部分菌株存在L4及L22的位點突變;對所有的親本株和耐藥菌株進行體內(nèi)及體外適應性分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生突變的高水平耐藥菌的適應性與其親本株相比大多數(shù)出現(xiàn)適應性下降僅A2059位點突變無適應性代價，甚至會提高突變菌株適應性。<

7、br>　　綜上所述，攜帶mefA-msrD的豬鏈球菌與參照敏感菌株的體外競爭力無顯著差異，mefA可介導DH5α對14-，15-元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素低度耐藥，且無適應性代價;攜帶ermB的豬鏈球菌JS07002與參照敏感菌株相比體外競爭力較低，ermB基因在顯著提高DH5α對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性的同時會降低其體外適應性。體外誘導得到的高水平大環(huán)內(nèi)酯類耐藥豬鏈球菌存在23S rRNA及核糖體蛋白L4、L22的結(jié)構(gòu)關(guān)鍵位點的突變。在23S r