大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性對(duì)腔腸彎曲桿菌毒力和適應(yīng)性的影響.pdf

1、空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性及其與細(xì)菌適應(yīng)性/毒力的關(guān)系在當(dāng)今世界備受關(guān)注。已有的研究顯示空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機(jī)制主要包括23S rRNA基因V區(qū)的位點(diǎn)突變、核糖體蛋白L4和L22的氨基酸突變、外輸泵蛋白的表達(dá)調(diào)控和其他未知機(jī)制。近兩年來,雖然已有報(bào)道顯示23S rRNA基因上的耐藥突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià),但是其他類型的耐藥突變(包括核糖體突變、核糖體和23S rRNA基因的聯(lián)合突變等)對(duì)細(xì)菌適應(yīng)性的影響尚未見報(bào)道

2、。雖然流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示大環(huán)內(nèi)酯類耐藥空腸彎曲桿菌比敏感菌的致病性更強(qiáng),然而目前尚無直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來分析其耐藥性和毒力的關(guān)系。隨著組學(xué)研究的發(fā)展,基因芯片技術(shù)為更深入、系統(tǒng)研究空腸彎曲桿菌耐藥性、適應(yīng)性和毒力的作用機(jī)制提供了有利工具。
　　 本研究首先應(yīng)用不同種大環(huán)內(nèi)酯類藥物(包括紅霉素、泰樂菌素和替米考星)體外長期誘導(dǎo)敏感性空腸彎曲桿菌,并測序鑒定耐藥菌株的突變類型。體外比較了各種耐藥突變菌相對(duì)敏感菌的適應(yīng)性(競爭生長力)

3、、生長性能、熱耐受力。特別比較了含有23S rRNlA基因A2074C突變的耐藥菌和敏感菌在體外培養(yǎng)基、細(xì)胞和動(dòng)物模型中的相對(duì)生長力、定植力和侵襲力,初步分析了23S rRNA基因上的A2074C耐藥突變和細(xì)菌毒力的相關(guān)性。為深入分析大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性與細(xì)菌毒力的作用機(jī)制,23S rRNA A2074C突變菌及其母源敏感菌被配對(duì)雜交,進(jìn)行基因芯片分析。在芯片結(jié)果分析的基礎(chǔ)上,本研究還考察了亞抑菌濃度的藥物對(duì)細(xì)菌鞭毛合成、組裝及細(xì)菌遷移力(

4、一種重要的毒力指標(biāo))的影響。
　　 測序結(jié)果顯示體外誘導(dǎo)的各耐藥菌含有不同類型的位點(diǎn)突變,包括23S rRNA基因上的A2074C或A2075G突變、核糖體蛋白L4編碼基因(rplD)的G170A突變以及核糖體蛋白L22編碼基因(rplV)上的G257A突變。此外,有一株耐藥菌不僅含有23S rRNA A2074C突變而且在rplV的265位存在AGTCGT的插入突變。這些含有不同位點(diǎn)突變的耐藥菌表現(xiàn)了不同程度的生長下降和適應(yīng)性

5、減弱。然而在熱耐受實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)行熱處理以后,所有菌的數(shù)量都嚴(yán)重下降,所以無法比較耐藥菌和敏感菌的差異。
　　 本實(shí)驗(yàn)特別比較了23S rRNA A2074C突變菌與敏感菌的毒力特性。其小鼠定植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變菌和敏感菌單獨(dú)接種到小鼠體內(nèi)后的21天內(nèi),兩菌的定植力沒有顯著差異；然而當(dāng)兩菌配對(duì)接種時(shí),耐藥突變菌在定植7天后就被清除,而敏感菌則可以繼續(xù)定植至21天。膽汁耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥菌比敏感菌的膽汁耐受力稍強(qiáng),但兩者沒有顯著差異。

6、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥菌對(duì)腸上皮細(xì)胞和鼠巨噬細(xì)胞的粘附和侵襲力比敏感菌弱,并且耐藥菌在巨噬細(xì)胞中的存活時(shí)間比敏感菌短。基因芯片結(jié)果顯示23S rRNA A2074C耐藥突變菌中的上調(diào)表達(dá)基因主要包括一些蛋白質(zhì)代謝和能量代謝基因及一些未知功能基因；而下調(diào)基因則主要參與細(xì)菌的遷移和熱應(yīng)激。
　　 當(dāng)使用亞抑菌濃度(sub-MIC)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物處理后,空腸彎曲桿菌在0.4％MH瓊脂平板上的遷移力受到抑制。在電子顯微鏡下,細(xì)菌鞭毛

7、缺失。然而SDS-PAGE和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示藥物處理對(duì)空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白的合成并沒有影響。由此推測大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以抑制細(xì)菌鞭毛體的組裝而不會(huì)影響鞭毛蛋白本身的合成。
　　 總結(jié)全文,本研究發(fā)現(xiàn)在空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥突變種中,核糖體蛋白IA和L22上的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià),并且當(dāng)核糖體和23SrRAM基因上同時(shí)出現(xiàn)突變時(shí),細(xì)菌表現(xiàn)高水平耐藥和嚴(yán)重的適應(yīng)性代價(jià)。此外,與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果不同的是,本實(shí)驗(yàn)的