大環(huán)內酯類耐藥性對腔腸彎曲桿菌毒力和適應性的影響.pdf

1、空腸彎曲桿菌對大環(huán)內酯類藥物的耐藥性及其與細菌適應性/毒力的關系在當今世界備受關注。已有的研究顯示空腸彎曲桿菌對大環(huán)內酯類的耐藥機制主要包括23S rRNA基因V區(qū)的位點突變、核糖體蛋白L4和L22的氨基酸突變、外輸泵蛋白的表達調控和其他未知機制。近兩年來,雖然已有報道顯示23S rRNA基因上的耐藥突變會導致細菌的適應性代價,但是其他類型的耐藥突變(包括核糖體突變、核糖體和23S rRNA基因的聯合突變等)對細菌適應性的影響尚未見報道

2、。雖然流行病學調查的數據顯示大環(huán)內酯類耐藥空腸彎曲桿菌比敏感菌的致病性更強,然而目前尚無直接的實驗數據來分析其耐藥性和毒力的關系。隨著組學研究的發(fā)展,基因芯片技術為更深入、系統(tǒng)研究空腸彎曲桿菌耐藥性、適應性和毒力的作用機制提供了有利工具。
　　 本研究首先應用不同種大環(huán)內酯類藥物(包括紅霉素、泰樂菌素和替米考星)體外長期誘導敏感性空腸彎曲桿菌,并測序鑒定耐藥菌株的突變類型。體外比較了各種耐藥突變菌相對敏感菌的適應性(競爭生長力)

3、、生長性能、熱耐受力。特別比較了含有23S rRNlA基因A2074C突變的耐藥菌和敏感菌在體外培養(yǎng)基、細胞和動物模型中的相對生長力、定植力和侵襲力,初步分析了23S rRNA基因上的A2074C耐藥突變和細菌毒力的相關性。為深入分析大環(huán)內酯類耐藥性與細菌毒力的作用機制,23S rRNA A2074C突變菌及其母源敏感菌被配對雜交,進行基因芯片分析。在芯片結果分析的基礎上,本研究還考察了亞抑菌濃度的藥物對細菌鞭毛合成、組裝及細菌遷移力(

4、一種重要的毒力指標)的影響。
　　 測序結果顯示體外誘導的各耐藥菌含有不同類型的位點突變,包括23S rRNA基因上的A2074C或A2075G突變、核糖體蛋白L4編碼基因(rplD)的G170A突變以及核糖體蛋白L22編碼基因(rplV)上的G257A突變。此外,有一株耐藥菌不僅含有23S rRNA A2074C突變而且在rplV的265位存在AGTCGT的插入突變。這些含有不同位點突變的耐藥菌表現了不同程度的生長下降和適應性

5、減弱。然而在熱耐受實驗中,進行熱處理以后,所有菌的數量都嚴重下降,所以無法比較耐藥菌和敏感菌的差異。
　　 本實驗特別比較了23S rRNA A2074C突變菌與敏感菌的毒力特性。其小鼠定植實驗結果顯示突變菌和敏感菌單獨接種到小鼠體內后的21天內,兩菌的定植力沒有顯著差異；然而當兩菌配對接種時,耐藥突變菌在定植7天后就被清除,而敏感菌則可以繼續(xù)定植至21天。膽汁耐受實驗結果顯示耐藥菌比敏感菌的膽汁耐受力稍強,但兩者沒有顯著差異。

6、細胞侵襲實驗結果顯示耐藥菌對腸上皮細胞和鼠巨噬細胞的粘附和侵襲力比敏感菌弱,并且耐藥菌在巨噬細胞中的存活時間比敏感菌短?；蛐酒Y果顯示23S rRNA A2074C耐藥突變菌中的上調表達基因主要包括一些蛋白質代謝和能量代謝基因及一些未知功能基因；而下調基因則主要參與細菌的遷移和熱應激。
　　 當使用亞抑菌濃度(sub-MIC)的大環(huán)內酯類藥物處理后,空腸彎曲桿菌在0.4％MH瓊脂平板上的遷移力受到抑制。在電子顯微鏡下,細菌鞭毛

7、缺失。然而SDS-PAGE和免疫印跡實驗結果卻顯示藥物處理對空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白的合成并沒有影響。由此推測大環(huán)內酯類藥物可以抑制細菌鞭毛體的組裝而不會影響鞭毛蛋白本身的合成。
　　 總結全文,本研究發(fā)現在空腸彎曲桿菌對大環(huán)內酯類藥物的耐藥突變種中,核糖體蛋白IA和L22上的突變會導致細菌的適應性代價,并且當核糖體和23SrRAM基因上同時出現突變時,細菌表現高水平耐藥和嚴重的適應性代價。此外,與流行病學調查結果不同的是,本實驗的