空腸彎曲菌cheY,ciaB,dnaJ,cfrA基因的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)作為人類的食源性病原菌,是引起急性胃腸道感染的主要病原菌之一。同時(shí),空腸彎曲菌還與人類急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病,即吉蘭-巴雷綜合征(GuillainBarrésyndrome,GBS)的發(fā)生密切相關(guān),是導(dǎo)致人類發(fā)生急性遲緩性癱瘓的重要病因。近年,分子生物學(xué)技術(shù)以及基因工程技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展,使得人們對(duì)空腸彎曲菌在分子生物學(xué)方面的機(jī)制有了深入的研究,特別是20

2、00年公布了C.jejuni NCTC11168(penner0:2血清型)的全基因組序列以來(lái),使得研究C.jejuni在分子水平的致病機(jī)制方面有了新的前景。空腸彎曲菌的致病機(jī)制主要包括侵襲、粘附、定植、產(chǎn)毒素,以及分子模擬等方面。已有研究表明,多種毒力因子共同參與空腸彎曲菌的致病過(guò)程。
　　 目的:本研究從基因水平出發(fā),應(yīng)用本地區(qū)已經(jīng)證實(shí)的具有致吉蘭-巴雷綜合癥特性的空腸彎曲菌血清型penner O:19 lulei菌株,選擇

3、該菌株中具有侵襲、粘附、定植及產(chǎn)毒素等特性的14個(gè)致病相關(guān)基因進(jìn)行TA克隆,經(jīng)測(cè)序后,與Genebank中C.jejuni NCTC11168中的相應(yīng)基因進(jìn)行比對(duì)分析,觀察相似性。再選擇14個(gè)基因中,保守性、免疫原性相對(duì)較強(qiáng)的4個(gè)基因進(jìn)行克隆,并插入真核表達(dá)載體pEF neo-myc,獲得真核表達(dá),為空腸彎曲菌基因工程疫苗的研制打下基礎(chǔ)。
　　 方法:擴(kuò)增目的基因以C.jeiuni penner O:19 lulei菌株為模板,

4、用PCR的方法分別擴(kuò)增grpE、dnaK、cheW、theY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA14個(gè)目的基因。
　　 TA克隆將14個(gè)目的基因分別連接到pGEM-T Easy載體,完成TA克隆。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)Top10或DH5a。經(jīng)培養(yǎng)后獲得質(zhì)粒,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切后凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序鑒定。應(yīng)用DNASTAR軟件與C.jejuni penner O:19 lul

5、ei菌株DNA序列及NCTC11168中的相應(yīng)基因進(jìn)行比對(duì)分析,得到相似指數(shù)。
　　 構(gòu)建真核表達(dá)載體選擇14個(gè)目的基因中,保守性、免疫原性較強(qiáng)的4個(gè)基因cheY、ciaB、dnaJ、cfrA,用Pyrobest PCR的方法擴(kuò)增4個(gè)基因后,應(yīng)用真核質(zhì)粒載體pEF neo-myc,以Kpn I和EcoR V,或Kpn I和Spe I為酶切位點(diǎn),分別構(gòu)建真核表達(dá)載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),得到質(zhì)粒并測(cè)序成功后,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)

6、染成功后用Western Blotting的方法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:成功擴(kuò)增并TA克隆出目的基因grpE、dnaK、cheW、cheY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ,由于基因cfrA片段長(zhǎng)度太大,將其分成兩段進(jìn)行擴(kuò)增并TA克隆。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并培養(yǎng)后,所得質(zhì)粒經(jīng)凝膠電泳檢測(cè),并測(cè)序鑒定后,應(yīng)用DNASTAR軟件與C.jejuni penner O:19 l

7、ulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相應(yīng)基因進(jìn)行比對(duì)分析。所得目的基因與C.jejuni penner O:19 lulei菌株DNA序列相同;與C.jejuni NCTC11168比對(duì),得出結(jié)果:基因dnaK、cheW、cheY、cheV、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA-1的相似指數(shù)分別在95.1％-100％,flaA的相似指數(shù)為92.6％,grpE的相似指數(shù)為89.9％,cf

8、rA-2的相似指數(shù)＜50％。應(yīng)用真核質(zhì)粒載體pEF neo-myc,成功構(gòu)建了基因cheY、ciaB、dnaJ及cfrA的真核表達(dá)載體。用Western Blotting的方法檢測(cè)到CheY',CiaB'及DanJ'蛋白的表達(dá),但未檢測(cè)到CfrA-1',CfrA-2'蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:成功擴(kuò)增并TA克隆出與空腸彎曲菌侵襲、粘附、定植及產(chǎn)毒素等特性相關(guān)的14個(gè)致病相關(guān)基因。應(yīng)用DNASTAR軟件與C.jejunipenne