利用串聯(lián)親和純化研究EHEC O157-H7 Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶蛋白復(fù)合物.pdf

1、腸出血型大腸桿菌O157:H7是重要的人類腸道致病菌，III型分泌系統(tǒng)復(fù)合物及其分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和效應(yīng)蛋白在其致病過程中發(fā)揮著重要作用。本研究以III型分泌系統(tǒng)的分子伴侶蛋白CesT和CesD為出發(fā)點(diǎn)，通過串聯(lián)親和純化（TAP）和非變性凝膠電泳（BN PAGE）為核心的復(fù)合物組學(xué)方法，分離靶蛋白參與形成的復(fù)合物，利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定參與靶蛋白復(fù)合物形成的蛋白組分，最后構(gòu)建以靶蛋白為核心的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。
　　技術(shù)路線為：在O157:H

2、7中表達(dá)融合了TAP標(biāo)簽的毒力蛋白，以溫和的方式裂解細(xì)菌，制備蛋白復(fù)合物樣品，通過串聯(lián)親和純化技術(shù)捕獲并富集靶蛋白參與形成的復(fù)合物；經(jīng)BN PAGE分離為獨(dú)立的復(fù)合物條帶，質(zhì)譜鑒定每個(gè)復(fù)合物條帶的蛋白成分，通過GST pull-down驗(yàn)證復(fù)合物組成蛋白間的相互作用關(guān)系。
　　本課題設(shè)計(jì)并構(gòu)建了兩個(gè)TAP表達(dá)載體pNTAP和pCTAP，分別將TAP標(biāo)簽融合于靶蛋白的N末端和C末端。首先以大腸桿菌中大量存在的分子伴侶GroEL為前期

3、試驗(yàn)對(duì)象，建立了成熟的串聯(lián)親和純化技術(shù)，分離鑒定到由靶蛋白形成的復(fù)合物，并且純化產(chǎn)物中沒有其它的蛋白復(fù)合物，表明串聯(lián)親和純化的特異性好。然后以III型分泌系統(tǒng)的分子伴侶蛋白CesT和CesD為靶蛋白，都分離鑒定到了含靶蛋白的復(fù)合物，且沒有非特異條帶，進(jìn)一步表明串聯(lián)親和純化的特異性較好。以CesT為靶蛋白捕獲的復(fù)合物，其中的兩個(gè)組成蛋白EF-Tu和GK（甘油激酶）分別通過GST pull-down實(shí)驗(yàn)證明了它們與靶蛋白CesT有直接相互作