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文檔簡介
1、大腸桿菌O157:H7是大腸桿菌中的一種具有高致病性的食源性致病血清型,有報道稱低于10個菌就能夠致病,如何快速靈敏地檢測大腸桿菌O157:H7引起了廣泛關注。因此,本文分別建立了傳統(tǒng)ELISA方法、基于生物素–鏈霉親和素信號放大的ELISA方法、集成雜交鏈式反應和生物素–鏈霉親和素信號放大的ELISA方法,旨在找到一種準確快速的ELISA方法高靈敏檢測大腸桿菌O157:H7。
本文首先采用傳統(tǒng)的雙抗夾心ELISA方法檢測大腸
2、桿菌O157:H7。通過優(yōu)化抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體的濃度,傳統(tǒng)的ELISA方法在培養(yǎng)基和牛奶樣品當中的靈敏度分別為4.88×104 CFU/mL和5.08×104 CFU/mL,變異系數(shù)分別為1.31%–6.87%和1.52%–7.81%。
采用生物素–鏈霉親和素信號放大ELISA方法檢測大腸桿菌O157:H7,通過優(yōu)化生物素化抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體濃度,在培養(yǎng)基和牛奶樣品中靈敏度分別為2×104 CF
3、U/mL和3.23×104 CFU/mL,變異系數(shù)分別為1.12%–8.63%和1.25%–9.61%。兩種傳統(tǒng)ELISA方法特異性良好,變異系數(shù)低,穩(wěn)定性好,均能實現(xiàn)對牛奶樣品的加標檢測,但兩種方法的靈敏度都較低。
本文最后構建了基于HCR及生物素–鏈霉親和素信號放大系統(tǒng)的雙抗夾心ELISA方法,實現(xiàn)了對大腸桿菌O157:H7的快速靈敏檢測。將大腸桿菌O157:H7的多抗包被在酶標板之后,加入標記了大腸桿菌O157:H7單抗
4、和DNA1引發(fā)序列的膠體金復合物。當存在目標菌株時,將會形成多抗–目標菌–單抗–膠體金–DNA1復合物。復合物與加入的生物素化H1和生物素化H2發(fā)生雜交鏈式反應,形成一個帶缺口的包含大量生物素的雙鏈結構DNA,生物素將與鏈霉親和素化的酶發(fā)生酶催化底物顯色反應。通過優(yōu)化膠體金探針單抗、多抗、生物素化H1及H2加入濃度,DNA1標記量,封閉劑的選擇,HCR反應時間,酶反應動力學時間及溫度,得到的最優(yōu)條件為:單抗標記量150μg/mL;多抗包
5、被濃度10μg/mL;生物素化H1及H2加入濃度0.25 nmol/mL;DNA1標記量400μL(1 nmol/mL);封閉劑選擇為3% BSA;HCR反應時間為75min;酶反應動力學時間和溫度分別為10 min和37℃。在最優(yōu)條件下,大腸桿菌O157:H7的檢測線性范圍為5×102–1×107 CFU/mL,在培養(yǎng)基和牛奶樣品中靈敏度分別為1.08×102 CFU/mL和2.60×102 CFU/mL。特異性實驗表明該方法特異性良
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