生物素-親和素放大系統(tǒng)時間分辨熒光免疫分析檢測CK-MB方法的建立.pdf

1、目的:
　　建立一種基于生物素-親和素放大系統(tǒng)的時間分辨熒光免疫分析（BA-TRFIA）檢測CK-MB新方法，在建立方法之前首先構(gòu)建PET28a-CK-MB重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)及純化CK-MB重組蛋白，并以其為參考標(biāo)準(zhǔn)品來建立BA-TRFIA檢測CK-MB新方法。
　　方法:
　　1. 人肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）的原核可溶性表達(dá)、純化及抗原性的鑒定
　　先將CK-M基因和CK-B基因分別與pMD19-T克隆

2、載體連接，然后將連接成功的CKB-pMD19-T與PET28a表達(dá)載體連接;然后將連接成功CKM-pMD19-T與CKB-PET28a連接;最后將構(gòu)建成功的PET28a-CK-MB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組蛋白CK-MB。通過時間分辨熒光免疫分析方法對純化后的CK-MB重組蛋白進(jìn)行抗原性鑒定及穩(wěn)定性研究。
　　2. BA-TRFIA方法的建立以本課題組表達(dá)制備的重組蛋白CK-MB作為參考標(biāo)準(zhǔn)品，將抗CK-MB抗

3、體H30330M包被到固相板上，對檢測抗體H31795M進(jìn)行生物素標(biāo)記及用Eu3+對鏈霉親和素(SA)進(jìn)行標(biāo)記。采用雙抗體夾心法，優(yōu)化包被抗體濃度、生物素標(biāo)記抗體用量、Eu3+-SA用量，確定最佳反應(yīng)條件，初步建立BA-TRFIA檢測CK-MB方法。
　　3. 方法學(xué)評價對BA-TRFIA方法進(jìn)行方法學(xué)評價，評價指標(biāo)包括特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低檢測限、批內(nèi)/批間精密度。
　　4. 臨床應(yīng)用使用本方法檢測150例健康體檢者血清中

4、CK-MB水平以計算出參考值范圍和陰性預(yù)測值及陽性確認(rèn)值。同時使用本方法和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法（CLIA）檢測100例CK-MB陰性標(biāo)本和150例心肌梗死患者CK-MB水平進(jìn)行方法學(xué)比對。
　　結(jié)果:
　　1. 人肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）的制備PCR、酶切及序列比對三種鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了PET28a-CK-MB重組質(zhì)粒，并誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白CK-MB，蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的55％以上，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后

5、，重組蛋白CK-MB在破菌上清及包涵體中均有表達(dá)，分子量約為92KD。對收集破菌上清進(jìn)行鎳柱親和層析純化，純度可達(dá)90％。純化后的重組蛋白CK-MB能夠與羊抗人CK-MB單抗特異性結(jié)合且在加入10％ BSA、2mmol/L EDTA的蛋白保護(hù)劑，-20℃保存條件下活性基本不變，穩(wěn)定性很好。
　　2. BA-TRFIA方法的建立本課題成功將包被抗體H30330M共價偶聯(lián)到固相板上，并成功對檢測抗體H31795M進(jìn)行生物素標(biāo)記及對SA

6、進(jìn)行Eu3+標(biāo)記。最佳反應(yīng)條件為:包被抗體H30330M最佳濃度3μg/ml、生物素化檢測抗體B-H31795M及Eu3+-SA最佳稀釋度均為1∶100;選擇孵育溫度為37℃，反應(yīng)時間均為30min。
　　3. 方法學(xué)評價BA-TRFIA檢測CK-MB的工作范圍為0-400μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9423，最低檢測限為0.1μg/L。批內(nèi)、批間精密度分別為1.3％～11.2％、8.0％～10.3％，與CK-MM、CK-BB、肌鈣蛋

7、白I及肌鈣蛋白T均無交叉反應(yīng)。
　　4. 臨床應(yīng)用對150例臨床健康體檢者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示健康體檢者血清CK-MB蛋白含量為0～0.81μg/L，陰性預(yù)測值為96％、陽性確認(rèn)值為0.426μg/L。方法學(xué)比對結(jié)果顯示兩種方法具有很強的相關(guān)性(r=0.92)。BA-TRFIA檢測150例CK-MB陽性標(biāo)本結(jié)果與患者相應(yīng)的心電圖、cTnⅠ、BNP的檢測結(jié)果相符。
　　結(jié)論:
　　本實驗成功構(gòu)建了PET28a-CK