玉米中ZEN化學(xué)發(fā)光及生物素-親和素標(biāo)記酶聯(lián)免疫分析法的建立.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),別名F-2毒素,是一種主要由禾谷鐮刀菌所產(chǎn)生的廣泛污染玉米及其制品的真菌毒素。它與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相似,通過與雌激素受體競爭性的結(jié)合,激活雌激素反應(yīng)元件,可引起一系列擬雌激素效應(yīng),對人體及動物具有生殖毒性、DNA和染色體毒性、免疫毒性、誘發(fā)腫瘤等。目前檢測ZEN的方法主要有微生物鑒定法、理化檢測法和免疫分析法等。免疫分析法操作簡單,對檢測人員的專業(yè)要求較低,且靈敏、快速、易于推廣,適用于大

2、量樣品的篩選,ELISA是其中最常見的一種類型。隨著社會的發(fā)展,人們對ZEN的檢測靈敏度越來越高,ELISA受到巨大的挑戰(zhàn)?；瘜W(xué)發(fā)光分析和生物素-親和素放大系統(tǒng)是兩種非常有效的提高免疫學(xué)檢測方法靈敏度的手段。本研究分別建立了檢測玉米中ZEN的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法及生物素.親和素酶聯(lián)免疫分析法。
　　 1玉米中ZEN間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)的建立
　　 采用辣根過氧化物酶(Horseradish pero

3、xidase,HRP)催化魯米諾一過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系,優(yōu)化并確定了化學(xué)發(fā)光酶免疫反應(yīng)的各種條件為:稀釋抗原至1.4μg／mL,4℃過夜包被12 h,1:40000稀釋抗ZEN抗體競爭反應(yīng)20 min,1:2000稀釋羊抗鼠IgG-HRP孵育反應(yīng)40 min。該方法分析靈敏度為0.09ng／mL,檢測線性范圍為0.104～1.69 ng／mL,批內(nèi)變異系數(shù)小于9.1％,批間變異系數(shù)小于14.7％,以玉米為樣品的分析回收率為79.6％～9

4、7.6％,樣品檢測時間為60 min。采用CLEIA和ELISA試劑盒分別測定了40份市售樣品,并分析了二者的相關(guān)性,兩者的線性相關(guān)系數(shù)為0.967。
　　 2玉米中ZEN直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(DC-CLEIA)的建立
　　 采用戊二醛法、高碘酸鈉法兩種方法分別制備了不同摩爾投料比的抗ZEN酶標(biāo)記抗體,紫外掃描結(jié)果和ELISA效價測試結(jié)果證明制備成功,且在效價測試中得知利用戊二醛法中單克隆抗體與HRP的摩爾投料比

5、為1:20時最好,高碘酸鈉法在摩爾投料比為1:1.5時獲得的酶標(biāo)記抗體效價最高,且高于戊二醛法中所有摩爾投料比的效價,此時酶標(biāo)記抗體的克分子比為1.07。
　　 采用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系,優(yōu)化并確定了直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫反應(yīng)的各種條件為:利用碳酸緩沖液稀釋包被抗原至0.8μg／mL,4℃過夜包被12 h,1:2000稀釋抗ZEN酶標(biāo)抗體競爭反應(yīng)20 min。該方法分析靈敏度為0.084 ng／mL,批內(nèi)變異系

6、數(shù)小于8.62％,批間變異系數(shù)小于15.7％,以玉米為樣品的分析回收率為77.0—95.3％,所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9902,檢測線性范圍為0.11-8.03 ng／mL,樣品檢測時間僅為20 min。建立的DC-CLEIA與ELISA試劑盒相比靈敏度提高了3倍。采用DC-CLEIA和ELISA試劑盒分別測定了19份市售樣品,并分析了二者的相關(guān)性,兩者的線性相關(guān)系數(shù)為0.925。
　　 3玉米中ZEN生物素-親和素酶聯(lián)免

7、疫分析法(BA-ELISA)的建立
　　 采用活潑酯法活化生物素,成功制備BNHS,并進(jìn)一步成功制備生物素化抗ZEN抗體。經(jīng)優(yōu)化BNHS與單克隆抗體IgG的反應(yīng)條件為:在pH7.5的緩沖液中37℃反應(yīng)1 h,抗體IgG與BNHS的摩爾投料比是1:100。
　　 采用高碘酸鈉法成功制備了酶標(biāo)記親和素,并對其稀釋液進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在兩種酶與親和素的摩爾投料比為2:1時比3:1時制備的酶標(biāo)記親和素效價高,非特異性吸附也較

8、強；增大酶標(biāo)記親和素稀釋液的離子強度是控制其非特異性吸附的有效方法；在BA—ELISA體系中,應(yīng)用摩爾投料比為3:1的酶標(biāo)記親和素,用5×PBS作為其稀釋液,非特異性吸附弱,信號放大作用強。
　　 采用棋盤滴定確定抗原包被和抗體工作稀釋度分別為1.6μg／mL、1:4000。經(jīng)優(yōu)化BA-ELISA其他的反應(yīng)條件為:生物素化抗體孵育時間為20 min,酶標(biāo)記親和素用5×PBS稀釋4000倍孵育30 min。該方法分析檢測限為0.4