EHEC O157-H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白對(duì)小鼠免疫保護(hù)及人工感染牛羊試驗(yàn).pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic Escerchia coli,EHEC)O157:H7是一種重要的動(dòng)物源性致病菌,易引起嬰幼兒及老人腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TIP)及溶血性尿毒綜合征(HUS)等嚴(yán)重并發(fā)癥,部分HUS病例可致死亡。該菌長(zhǎng)期駐留于牛、羊,豬、雞等家畜家禽的腸道中,牛是其主要的貯存宿主,造成幼齡動(dòng)物腹瀉,并污染畜禽產(chǎn)品及水源和農(nóng)作物等,給農(nóng)牧業(yè)帶來(lái)巨大的損失,也對(duì)人們的

2、健康構(gòu)成巨大威脅。自首次于美國(guó)發(fā)現(xiàn)因該菌引起的食物中毒以來(lái),疫情不斷擴(kuò)散蔓延,在多個(gè)國(guó)家相繼引起暴發(fā)流行,我國(guó)于2000年也發(fā)生暴發(fā)流行,危害程度可能是迄今為止最嚴(yán)重的一次。目前還沒(méi)有理想的疫苗能夠防治該菌引起的感染。研制能夠減少宿主動(dòng)物排菌的疫苗,以減少傳染源對(duì)人類健康的威脅是該領(lǐng)域的主要研究方向。
　　 1.O157:H7 pCold I-tir-tccp重組質(zhì)粒的構(gòu)建和融合蛋白的表達(dá)
　　 采用PCR方法獲得目的基

3、因tir-tccp,構(gòu)建pCold I-tir-tccp重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后IPTG誘導(dǎo),超聲破菌后SDS—PAGE檢測(cè)目的蛋白主要存在于上清,表明Tir-Tccp蛋白以可溶形式表達(dá)。Western blot鑒定目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　 2.腸出血性大腸桿菌O157:H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白對(duì)小鼠免疫保護(hù)性研究研究不同濃度的O157:H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白

4、對(duì)接受1×1010CFU O157:H7小鼠的免疫保護(hù)作用。將Intimin和Tir-Tccp蛋白和佐劑充分乳化后,通過(guò)背部和腹部皮膚皮下多點(diǎn)注射的方式免疫小鼠,對(duì)照組注射等量的PBS。共免疫兩次,間隔14d,末次免疫后的14d攻毒O157:H71×1010CFU/只.在每次免疫后的14d通過(guò)斷尾采血,用間接ELISA檢測(cè)血清抗體。攻毒后,觀察小鼠精神狀態(tài),記錄死亡數(shù)并檢測(cè)排菌。ELISA結(jié)果表明,Tir-Tccp蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG

5、抗體水平明顯升高,而Intimin誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體升高不明顯。攻毒后,兩個(gè)免疫組小鼠均死亡1只,存活14只,存活率為93.3％；對(duì)照組小鼠死亡4只,存活6只,存活率為60％。免疫組在攻毒后6d,糞便中檢測(cè)不到O157:H7；而對(duì)照組在攻毒后13d仍有較高的排菌量。本實(shí)驗(yàn)表明緊密素和Tir-Tccp蛋白對(duì)小鼠起到了有效的免疫保護(hù)性作用,能夠減少O157:H7在小鼠體內(nèi)的定植。
　　 3.腸出血性大腸桿菌O157:H7感染牛羊試

6、驗(yàn)
　　 以1×1010CFU/只EHEC O157:H7的劑量通過(guò)灌胃方式攻毒動(dòng)物,檢測(cè)牛、羊的糞便排菌量和排菌時(shí)間。攻毒前,所有動(dòng)物飲用5g/L的鏈霉素溶液3d,目的是增強(qiáng)O157:H7在腸道內(nèi)的定植。攻毒前所有動(dòng)物禁水、禁食12h,攻毒后12h恢復(fù)飲水、飲食。攻毒后給予所有動(dòng)物0.5g/L的鏈霉素溶液。攻毒后的24h開始檢測(cè)糞便的排菌量。結(jié)果顯示,牛最長(zhǎng)排菌時(shí)間為17d,最高排菌量達(dá)5×105CFU；羊最長(zhǎng)排菌時(shí)間達(dá)13d