EHEC O157-H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白對小鼠免疫保護及人工感染牛羊試驗.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic Escerchia coli,EHEC)O157:H7是一種重要的動物源性致病菌,易引起嬰幼兒及老人腹瀉、出血性結腸炎(HC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TIP)及溶血性尿毒綜合征(HUS)等嚴重并發(fā)癥,部分HUS病例可致死亡。該菌長期駐留于牛、羊,豬、雞等家畜家禽的腸道中,牛是其主要的貯存宿主,造成幼齡動物腹瀉,并污染畜禽產品及水源和農作物等,給農牧業(yè)帶來巨大的損失,也對人們的

2、健康構成巨大威脅。自首次于美國發(fā)現因該菌引起的食物中毒以來,疫情不斷擴散蔓延,在多個國家相繼引起暴發(fā)流行,我國于2000年也發(fā)生暴發(fā)流行,危害程度可能是迄今為止最嚴重的一次。目前還沒有理想的疫苗能夠防治該菌引起的感染。研制能夠減少宿主動物排菌的疫苗,以減少傳染源對人類健康的威脅是該領域的主要研究方向。
　　 1.O157:H7 pCold I-tir-tccp重組質粒的構建和融合蛋白的表達
　　 采用PCR方法獲得目的基

3、因tir-tccp,構建pCold I-tir-tccp重組質粒。轉化E.coliBL21(DE3)后IPTG誘導,超聲破菌后SDS—PAGE檢測目的蛋白主要存在于上清,表明Tir-Tccp蛋白以可溶形式表達。Western blot鑒定目的蛋白具有良好的反應原性。
　　 2.腸出血性大腸桿菌O157:H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白對小鼠免疫保護性研究研究不同濃度的O157:H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白

4、對接受1×1010CFU O157:H7小鼠的免疫保護作用。將Intimin和Tir-Tccp蛋白和佐劑充分乳化后,通過背部和腹部皮膚皮下多點注射的方式免疫小鼠,對照組注射等量的PBS。共免疫兩次,間隔14d,末次免疫后的14d攻毒O157:H71×1010CFU/只.在每次免疫后的14d通過斷尾采血,用間接ELISA檢測血清抗體。攻毒后,觀察小鼠精神狀態(tài),記錄死亡數并檢測排菌。ELISA結果表明,Tir-Tccp蛋白誘導小鼠產生IgG

5、抗體水平明顯升高,而Intimin誘導產生的IgG抗體升高不明顯。攻毒后,兩個免疫組小鼠均死亡1只,存活14只,存活率為93.3％；對照組小鼠死亡4只,存活6只,存活率為60％。免疫組在攻毒后6d,糞便中檢測不到O157:H7；而對照組在攻毒后13d仍有較高的排菌量。本實驗表明緊密素和Tir-Tccp蛋白對小鼠起到了有效的免疫保護性作用,能夠減少O157:H7在小鼠體內的定植。
　　 3.腸出血性大腸桿菌O157:H7感染牛羊試

6、驗
　　 以1×1010CFU/只EHEC O157:H7的劑量通過灌胃方式攻毒動物,檢測牛、羊的糞便排菌量和排菌時間。攻毒前,所有動物飲用5g/L的鏈霉素溶液3d,目的是增強O157:H7在腸道內的定植。攻毒前所有動物禁水、禁食12h,攻毒后12h恢復飲水、飲食。攻毒后給予所有動物0.5g/L的鏈霉素溶液。攻毒后的24h開始檢測糞便的排菌量。結果顯示,牛最長排菌時間為17d,最高排菌量達5×105CFU；羊最長排菌時間達13d