腸出血型大腸埃希菌O157-H7 EspF蛋白靶向結(jié)合線粒體并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 腸出血型大腸埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157∶H7是一種食源性人畜共患腸道病原微生物，可引起人和動(dòng)物嚴(yán)重的腹瀉、出血性腸炎(haemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thromobocytopenic p

2、orpura，TTP)等。1983年，Riley等首次報(bào)道了發(fā)生在美國(guó)的腸出血型大腸埃希菌O157∶H7引起的嚴(yán)重食源性疾病—出血性結(jié)腸炎。此后，由EHEC O157∶H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)在世界范圍內(nèi)不斷發(fā)生。2000年，據(jù)世界衛(wèi)生組織( WHO)報(bào)告，在加拿大Ontario市Walkerton區(qū)發(fā)生了一起5000人口的EHEC O157∶H7的暴發(fā)流行，其中27人住院治療，5人死亡，據(jù)報(bào)道暴發(fā)流行是由Walkerton區(qū)的供水

3、系統(tǒng)受到污染引起的。世界各地，腸出血型大腸埃希菌O157∶H7的暴發(fā)與流行仍時(shí)有發(fā)生，發(fā)病呈上升趨勢(shì)，由于病情兇險(xiǎn)，病死率高(HUS死亡率90％以上)，已引起各國(guó)政府及醫(yī)療衛(wèi)生、科研機(jī)構(gòu)的高度重視。
　　 EHEC O157∶H7的致病機(jī)制目前尚不十分清楚，其主要致病基因有志賀樣毒素基因( stx)、大毒力質(zhì)粒pO157和染色體腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)LEE(the locus ofenterocyte effacement，LEE)致病

4、島等。EHEC O157∶H7感染引起的典型病理特征是腸上皮細(xì)胞黏附-抹去（attaching and effacing，A/E）損傷。目前研究認(rèn)為，引起黏附-抹去（attaching and effacing，A/E）損傷的毒力因子大多位于其LEE致病島，效應(yīng)蛋白多達(dá)20多種，其中效應(yīng)蛋白EspF的作用范圍最大，是多功能性的。EspF蛋白可以突破腸上皮屏障，定位于宿主細(xì)胞的線粒體，啟動(dòng)線粒體途徑的凋亡，且EspF的N端是線粒體靶向信號(hào)

5、(mitochondrial targeting signal，MTS)功能區(qū)，因?yàn)閷TS區(qū)缺失突變，EspF蛋白靶向結(jié)合于宿主線粒體的功能消失。利用谷氨酸代替EspF的第16位亮氨酸，EspF靶向結(jié)合于宿主細(xì)胞線粒體的功能完全消失，因此認(rèn)為MTS的第16位亮氨酸是EspF蛋白重要的功能部位。EspF蛋白遷移到宿主細(xì)胞線粒體后，與線粒體靶向結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞線粒體途徑的凋亡:引起線粒體膜通透性改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞色素C

6、從線粒體釋放到細(xì)胞漿，引起Caspase家族蛋白酶-9和Caspase家族蛋白酶-3的裂解。感染后期EspF在核仁聚集，并且這一過程受線粒體調(diào)控，這種機(jī)制的闡明將為細(xì)菌蛋白在宿主細(xì)胞的時(shí)空調(diào)控機(jī)制揭開新的篇章。近來，一些研究發(fā)現(xiàn)EspF可以通過SH3和EVH1結(jié)構(gòu)域分別與宿主蛋白SNX9(sortingnexin9)和Wiskott- Aldrich綜合征蛋白(Wiskott- Aldrich syndrome protein，WASP

7、)結(jié)合，認(rèn)為EspF集合SNX9和WASP，形成新的信號(hào)模仿物，導(dǎo)致上皮細(xì)胞緊密連接破壞、微絨毛消失、細(xì)胞骨架重排、肌動(dòng)蛋白聚集、墊狀結(jié)構(gòu)(pedestal)形成，最后引起細(xì)胞程序性凋亡，這在A/E損傷中起主要作用。學(xué)術(shù)界，效應(yīng)蛋白EspF被認(rèn)為是病原細(xì)菌致病的瑞士軍刀，對(duì)于研究EHEC致病的分子機(jī)制至關(guān)重要。
　　 盡管近些年對(duì)EspF有了更深一步的研究，證實(shí)EspF可以突破腸上皮屏障，降低宿主細(xì)胞的跨膜電阻，破壞腸屏障功能，

8、參與破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接，但EspF蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡的機(jī)制仍然不是很清楚。那么EHEC O157∶H7的EspF蛋白，是否對(duì)細(xì)菌的黏附性、在宿主細(xì)胞的定位及對(duì)線粒體途徑的凋亡都有影響呢？本實(shí)驗(yàn)的前期研究中，我們采用重疊延伸PCR(OL-PCR)和同源重組技術(shù)，已成功構(gòu)建了espF基因缺失突變株EHEC O157∶H7(△espF)，該突變株表達(dá)的EspF蛋白N端第15-68個(gè)氨基酸殘基缺失，這就為我們進(jìn)一步研究EspF蛋白的功能奠

9、定了基礎(chǔ)。鑒于目前尚缺乏商品化EHEC O157∶H7 EspF蛋白抗體，本研究從制備EHEC O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體開始，并進(jìn)行純化和鑒定，進(jìn)而運(yùn)用該抗體通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證明EHEC O157∶H7 EspF蛋白和宿主細(xì)胞線粒體的共同定位趨勢(shì)，并用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒比較野生株和突變株引起宿主細(xì)胞早期凋亡的程度，可望揭示EspF蛋白在EHEC O157∶H7感染導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附-抹去損傷中的分子機(jī)制。

10、>　　 二、研究方法
　　 1.腸出血型大腸埃希菌O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體的制備和初步純化
　　 (1)抗原設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用DNAStar軟件子程序Protean，分別采用Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案預(yù)測(cè)氨基酸親水性，采用Karplus-Schultz和Emini方案預(yù)測(cè)柔韌性及表面可能性，采用Jameson-Wolf方案和吳氏抗原指數(shù)法預(yù)測(cè)潛在的B細(xì)胞抗原表位。選取B細(xì)胞表位的優(yōu)

11、勢(shì)區(qū)段，在其C端通過半胱氨酸( Cys)偶聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)。設(shè)計(jì)的抗原委托上海吉爾生化有限公司合成。
　　 (2)多克隆抗體的制備和初步純化2只新西蘭白兔（體重1.5～2.5kg，分別編號(hào)為1、2），免疫前耳緣靜脈取血2ml，分離血清，-20℃冷凍保存作為對(duì)照。免疫時(shí)間為第1、28、42、66天，每次用量為1mg/兔。抗原蛋白溶于2ml生理鹽水，初次免疫時(shí)與等體積的福氏完全佐劑乳化均勻，家兔背部及肩胛部皮內(nèi)多點(diǎn)注射（2m

12、l/只），加強(qiáng)免疫時(shí)用福氏不完全佐劑乳化均勻，家兔兩肩兩腿部肌肉注射。在第二次加強(qiáng)免疫后，采兔耳緣靜脈血1ml制備血清，ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)，以檢驗(yàn)是否有抗體產(chǎn)生。最后一次免疫10d后，ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)，心臟取全血約80ml，分離血清，-20℃分裝凍存?zhèn)溆?。通過間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，Western blot檢測(cè)抗血清特異性。并用辛酸-硫酸銨法純化抗血清，SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度。
　　 2.EHEC分泌的

13、 EspF蛋白在宿主lovo細(xì)胞的亞定位共聚焦培養(yǎng)皿接種lovo細(xì)胞，至細(xì)胞長(zhǎng)滿至80％。腸出血型大腸埃希菌O157∶H7(野生株和espF基因缺失突變株(△espF)），190rpm，37℃搖動(dòng)孵育12h。細(xì)菌作用于細(xì)胞2h（細(xì)胞∶細(xì)菌=1:100）（空白對(duì)照control未加細(xì)菌作用）。PBS洗滌三遍，10min/次。4％多聚甲醛室溫固定30min。0.05％Triton室溫作用20min。PBS洗滌2次，5min次。含1％BSA的

14、PBS室溫封閉1h。稀釋1抗4℃孵育18h。PBS洗滌三次，10min/次。熒光2抗室溫避光孵育45min。PBS洗滌三次，10min/次。DAPI室溫避光孵育3-5min。PBS洗滌2次，5min/次。激光共聚焦顯微鏡拍照、分析。
　　 3.細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)lovo細(xì)胞進(jìn)行載玻片爬片后，細(xì)菌感染作用于細(xì)胞2h后PBS洗滌，電鏡專用2.5％的戊二醛固定液置4℃固定2h，送電鏡室進(jìn)一步處理、鏡檢。
　　 4.細(xì)胞凋亡線粒體膜電

15、位檢測(cè)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種lovo細(xì)胞，至細(xì)胞長(zhǎng)滿至80％。腸出血型大腸埃希菌O157∶H7(野生株和espF基因缺失突變株(△espF)），190rpm，37℃搖動(dòng)孵育12h。細(xì)菌作用于細(xì)胞（細(xì)胞∶細(xì)菌=1:100）分別0.5、1.5、2.5h（空白對(duì)照control未加細(xì)菌作用）。PBS洗滌三遍，10min/次。按照J(rèn)C-1試劑盒說明書操作。熒光顯微鏡鏡檢、拍照。
　　 三、結(jié)果
　　 1.制備和純化了腸出血型大腸埃

16、希菌O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體間接ELISA法檢測(cè)多抗血清效價(jià)，第二次加強(qiáng)免疫后測(cè)定抗血清效價(jià)，1號(hào)兔子為1:1024000，2號(hào)兔子為1:512000，表明有抗體產(chǎn)生。加強(qiáng)免疫三次后1、2號(hào)白兔的抗血清效價(jià)均可達(dá)1:2048000。Western blot證實(shí)免疫前血清和EHECO157∶H7野生株及espF基因缺失突變株的EspF蛋白無反應(yīng)，免疫后血清對(duì)EHEC O157∶H7野生株和espF基因缺失突變株的EspF蛋白

17、均有特異性?？寡褰?jīng)辛酸-硫酸銨法純化后，SDS-PAGE電泳可見分子量為55kD和22kD的2條帶，分別相當(dāng)于抗體的重鏈和輕鏈，證明抗血清經(jīng)純化后可獲得一定純度的抗體。
　　 2.EHEC分泌的EspF蛋白靶向結(jié)合于宿主細(xì)胞的線粒體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)EHECO157∶H7野生株的EspF蛋白綠色熒光信號(hào)強(qiáng)，對(duì)應(yīng)部位的線粒體熱休克蛋白70的紅色熒光信號(hào)也強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性，EspF蛋白與線粒體熱休克蛋白70存在明顯的共同定位現(xiàn)象。e

18、spF基因缺失突變株EspF蛋白綠色熒光信號(hào)較強(qiáng)，而對(duì)應(yīng)部位的線粒體熱休克蛋白70的紅色熒光信號(hào)或強(qiáng)或弱，沒有明顯的相關(guān)性，無共同定位趨勢(shì)，說明EspF蛋白結(jié)合線粒體的能力下降。空白對(duì)照組（即未加細(xì)菌作用組）未檢測(cè)到EspF蛋白的綠色熒光信號(hào)。這在沿直線的熒光信號(hào)強(qiáng)度掃描比對(duì)中得到進(jìn)一步證實(shí):野生株組沿直線的綠色和紅色的熒光強(qiáng)度曲線走勢(shì)是一致的，表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性，而espF基因缺失突變株組沿直線的綠色和紅色的熒光強(qiáng)度曲線走勢(shì)無相關(guān)性

19、。這也說明野生株EspF蛋白靶向結(jié)合于宿主細(xì)胞的線粒體，而突變株的結(jié)合能力下降。
　　 那么，EspF蛋白是否與細(xì)胞核結(jié)合呢？在細(xì)胞核所在部位，EHEC野生株EspF蛋白發(fā)出的綠色熒光信號(hào)比較弱，突變株則幾乎觀察不到綠色熒光信號(hào)。同樣的沿直線進(jìn)行細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度掃描發(fā)現(xiàn):EHEC野生株EspF蛋白的綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度，與細(xì)胞核DNA發(fā)出的藍(lán)色熒光信號(hào)強(qiáng)度走勢(shì)向背，espF基因缺失突變株EspF蛋白的綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度，與細(xì)胞核D

20、NA發(fā)出的藍(lán)色熒光信號(hào)強(qiáng)度走勢(shì)也是向背的，都表現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)性，這表明EHEC野生株和espF基因缺失突變株的EspF蛋白都未在細(xì)胞核聚集。
　　 3.細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)EHEC O157∶H7野生株和espF基因缺失突變株作用結(jié)腸癌細(xì)胞lovo細(xì)胞后，培養(yǎng)，固定，處理樣品，電子顯微鏡觀察，EHEC O157∶H7野生株作用于lovo細(xì)胞2h，可見細(xì)胞膜表面聚集大量的細(xì)菌，未見細(xì)胞膜有明顯損傷。突變株作用于lovo細(xì)胞2h，可見細(xì)胞

21、膜上有較少細(xì)菌黏附，未見細(xì)胞膜有明顯損傷。陰性對(duì)照DH5α作用于lovo細(xì)胞2h，可見細(xì)胞的細(xì)胞膜完整整齊，膜上有極少量細(xì)菌黏附。
　　 4.細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)線粒體膜電位變化:正常細(xì)胞，為高紅高綠（紅:++，綠:++）。當(dāng)野生株、突變株與lovo細(xì)胞作用0.5h時(shí)，EHEC野生株表現(xiàn)出明顯的熒光強(qiáng)度改變，紅色熒光減少，綠色熒光增加;而espF基因缺失突變株還可觀察到明顯的紅色熒光，綠色熒光沒有野生株強(qiáng)

22、，說明細(xì)菌與細(xì)胞作用0.5h時(shí)，線粒體膜電位已經(jīng)明顯的降低，細(xì)胞已開始凋亡，且野生株比espF基因缺失突變株快。在細(xì)菌與細(xì)胞作用1.5h時(shí)，EHEC野生株紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，而espF基因缺失突變株熒光強(qiáng)度的改變進(jìn)程稍慢。在細(xì)菌與細(xì)胞作用2.5h時(shí)，EHEC野生株紅色熒光基本消失，綠色熒光達(dá)到最大強(qiáng)度，而espF基因缺失突變株還可觀察到低強(qiáng)度的紅色熒光，說明細(xì)菌與細(xì)胞作用2.5h，野生株導(dǎo)致細(xì)胞凋亡程度比espF基因缺失

23、突變株強(qiáng)。這表明EHEC野生株對(duì)線粒體的毒性作用明顯大于espF基因缺失突變株，espF基因的缺失使EspF蛋白誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡能力減弱。
　　 四、結(jié)論
　　 1.成功地制備了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的EHEC O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體。
　　 2.EHEC O157∶H7的EspF蛋白在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞的過程中定位于宿主細(xì)胞的線粒體，且EspF蛋白的N端是線粒體靶向信號(hào)(mitochondrial