腸出血型大腸埃希菌O157-H7候選疫苗的構(gòu)建及動物效果評價.pdf

1、目的:
　　腸出血型大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7為人畜共患病，臨床上可引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥。目前對EHECO157∶H7感染尚缺乏有效的防治措施，安全有效的疫苗是預防其感染的首選。本研究選擇EspA和Tir兩個關(guān)鍵性定植功能蛋白候選抗原，同時構(gòu)建具EspA-Tir-M融合蛋白為抗原的亞單位候選疫苗和以嗜酸乳桿菌為抗原投遞系統(tǒng)的活載體候選疫苗

2、菌株，并評價其保護效果。
　　方法:
　　首先通過重疊延伸PCR方法擴增目的片段EspA-Tir-M，將EspA-Tir-M與原核質(zhì)粒pET28a(+)連接，構(gòu)建大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，通過誘導蛋白表達和純化濃縮蛋白EspA-Tir-M。將制備EspA-Tir-M蛋白分別通過滴鼻和皮下注射兩種方式免疫小鼠，測定小鼠血清IgG、糞便SIgA，血清中細胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的表達水平，并進行攻毒實驗，觀察小鼠的死亡

3、率、排菌量及組織病理切片，對比兩種免疫方式的保護效果;其次，再將EspA-Tir-M融合基因與pMG36e質(zhì)粒連接后電轉(zhuǎn)化至嗜酸乳桿菌感受態(tài)，構(gòu)建表達EspA-Tir-M的重組嗜酸乳桿菌，并進行多重PCR和測序鑒定重組嗜酸乳桿菌，進行SDS-PAGE及Western Blot分析重組嗜酸乳桿菌表達的蛋白情況;并通過體內(nèi)外實驗評價該重組嗜酸乳桿菌的保護效果，體外實驗通過競爭、排斥實驗和細胞骨架染色，觀察重組嗜酸乳桿菌抑制EHEC O157

4、∶H7黏附LoVo細胞及預防A/E損傷形成的效果，體內(nèi)考察重組嗜酸乳桿菌灌胃免疫小鼠后，誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體和細胞因子的表達水平，以及EHEC O157∶H7攻毒后對小鼠的保護效果。
　　結(jié)果:
　　本實驗成功構(gòu)建EspA-Tir-M原核表達系統(tǒng)，且誘導表達的EspA-Tir-M主要以可溶性形式存在，純化后蛋白純度可達90％，將蛋白采取皮下和滴鼻兩種免疫方式，結(jié)果表明滴鼻免疫比皮下免疫可更好的誘導小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性I

5、gG和SIgA，滴鼻免疫可提高IL-4、IL-10和IFN-γ的表達水平，而皮下免疫只能提高IL-10和IFN-γ的表達水平，此外，滴鼻免疫的保護率高達88.9％，病理切片也顯示滴鼻免疫可有效預防EHEC O157∶H7對腸道的損傷，而皮下免疫的保護效果則較差。同時首次成功構(gòu)建了表達EHEC O157∶H7EspA-Tir-M蛋白的重組嗜酸乳桿菌，且主要以外分泌表達可溶性蛋白;重組嗜酸乳桿菌體外實驗可競爭性排斥達60％EHEC O157

6、∶H7黏附LoVo細胞，而預防性排斥高達94％，并且可阻止EHEC O157∶H7對LoVo細胞造成A/E損傷;體內(nèi)實驗表明重組嗜酸乳桿菌可誘導小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG和SIgA，提高小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IL-10的表達水平，對小鼠的保護率達77.8％，并有效縮短糞便排菌量和排菌時間，病理切片顯示有效減輕EHEC O157∶H7引起的A/E損傷。
　　結(jié)論:
　　本研究首次構(gòu)建了預防EHEC O157∶H7的新型