EHEC O157：H7緊密粘附素胞外區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)及功能研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7是一種重要的新發(fā)傳染病病原菌。自1975年被首次分離、1982年被確認(rèn)為致病菌以來的20多年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157：H7感染可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis，HC)，還可在5～10％的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hlemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thrombotic th

2、rombocytopenic purpura，TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。EHEC O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險(xiǎn)性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。 病原微生物與宿主的相互作用是決定其感染、發(fā)病和預(yù)后的關(guān)鍵。粘附定植是O157致病前提。緊密粘附素(Intimin)是O157最主要的定植因子，尤其是它的C端1/3部分(Intimin-C)為胞外功能區(qū)，與相應(yīng)受體

3、(轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體，translocated intiminreceptor，Tir)結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞的緊密粘附，是細(xì)菌的重要致病因子。Tir是O157細(xì)菌本身基因編碼的受體蛋白質(zhì)，通過其Ⅲ型分泌系統(tǒng)最終整合于宿主細(xì)胞膜上，行使緊密粘附素受體的功能。解析緊密粘附素(Intimin)的結(jié)構(gòu)以及研究緊密粘附素(Intimin)與轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體Tir蛋白的相互作用特點(diǎn)有助深入認(rèn)識(shí)EHECO157：H7粘附定植的分子機(jī)制和致病機(jī)

4、理。據(jù)此有可能發(fā)現(xiàn)更加高效特異的疫苗抗原表位和新的藥物作用靶點(diǎn)。 基于以上認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)擬克隆表達(dá)緊密粘附素(Intimin)及轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體Tir蛋白的相互作用功能區(qū)，進(jìn)行晶體培養(yǎng)結(jié)構(gòu)解析與功能驗(yàn)證的相關(guān)研究。 1．對(duì)O157：H7的IntiminCl88及轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體Tir結(jié)合片段(Tir-M)進(jìn)行基因克隆表達(dá)復(fù)性純化，獲得有活性高純度的蛋白。設(shè)計(jì)引物采用PCR法自O(shè)157菌基因組擴(kuò)增IntiminCl88、

5、Tir-M的編碼基因eae-c188與tir-m，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)-eaeCl88和pET-21a(+)-tir-m，經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，PAGE電泳檢測。目的蛋白IntiminC188經(jīng)包涵體洗滌后復(fù)性，再用陰離子交換柱純化；Tir-M經(jīng)超聲破菌后鎳離子親和純化，再用陰離子交換柱純化。結(jié)果顯示PCR法自O(shè)157菌基因組分別擴(kuò)增出了約600bp和280bp的目的片段；原

6、核表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m經(jīng)酶切及測序鑒定，所擴(kuò)增的TirM基因序列與GenBank公布的序列完全一致，而eaeC188基因序列與GenBank的序列相比較有一個(gè)堿基的突變，導(dǎo)致表達(dá)的蛋白有一個(gè)關(guān)鍵氨基酸的突變(intiminN916Y)。更換高保真的pfu DNA polymerase重新擴(kuò)增目的基因，再次構(gòu)建克隆。重新構(gòu)建的克隆經(jīng)測序正確無誤。轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)

7、后IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，PAGE電泳初步測定目的蛋白的分子量與預(yù)期一致。破菌后電泳證實(shí)目的蛋白IntiminCl88及突變體以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)包涵體洗滌、復(fù)性和陰離子交換柱純化后目的蛋白純度>95％；目的蛋白Tir-M以可溶蛋白形式表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和純化與陰離子交換柱純化后目的蛋白純度>95％。適合進(jìn)行蛋白晶體培養(yǎng)和功能研究。 2．在獲得高純度intiminC188及突變體intiminN916Y蛋白的基礎(chǔ)上，使用Hamp

8、tonResearch(Laguna Nigel，CA，USA)公司的晶體初篩試劑盒crystal screen Kit Ⅰ和kit Ⅱ，氣相擴(kuò)散懸滴法進(jìn)行初步的結(jié)晶條件篩選。對(duì)篩選獲得質(zhì)量較好的晶體進(jìn)行X-線衍射收集衍射數(shù)據(jù)。分子置換法進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。結(jié)果獲得了質(zhì)量較好的intiminC188及突變體intiminN916Y蛋白晶體和衍射數(shù)據(jù)，并解析了晶體結(jié)構(gòu)。分析了intiminC188及突變體intimi

9、nN916Y蛋白晶體的細(xì)微差別，并對(duì)intiminCl88的晶體結(jié)構(gòu)與分子置換的模型EPEC的intiminC結(jié)構(gòu)(PDB，編號(hào)IF00)進(jìn)行結(jié)構(gòu)重疊比對(duì)分析，其結(jié)構(gòu)總體相似，但細(xì)節(jié)有一定差別。 3．在對(duì)IntiminC188及突變體和轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體Tir的Intimin結(jié)合片段(Tir-M或Tir-IBD)進(jìn)行克隆表達(dá)復(fù)性純化的基礎(chǔ)上，利用BIACore 3000系統(tǒng)對(duì)IntiminC188及突變體與Tir-IBD進(jìn)行了親

10、和力與結(jié)合動(dòng)力學(xué)的研究。通過比較緊密粘附素突變前后與受體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)特征改變，證實(shí)了916位氨基酸對(duì)于緊密粘附素與受體結(jié)合的特殊意義。結(jié)合緊密粘附素及其突變體的晶體結(jié)構(gòu)分析，916位氨基酸由N變?yōu)閅后，緊密粘附素的結(jié)合力改變與其晶體結(jié)構(gòu)變化相吻合，從結(jié)構(gòu)和功能的角度能夠相互印證。 綜上所述，本研究采用基因工程技術(shù)成功表達(dá)IntiminCl88及突變體和轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體Tir的Intimin結(jié)合片段(Tir-M或Tir-IBD)