基于EHEC O157：H7志賀毒素ⅡB細胞表位肽的中和性MAb制備與生物學(xué)鑒定.pdf

1、本課題將以EHEC O157:H7 Stx2的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，輔以DNAStar軟件分析，預(yù)測并篩選靶向Stx2 A1片段毒性活性中心的保護性B細胞表位肽，利用此肽制備靶向Stx2毒性活性中心的中和性單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上制備Fab基因工程抗體，以期獲得具有臨床治療價值的中和性抗體。本研究主要分四個部分： 第一部分基于EHEC O157:H7 Stx2晶體結(jié)構(gòu)的B細胞表位肽的預(yù)測與免疫原性鑒定 Stx2保護性B細胞表位

2、肽的預(yù)測與鑒定是利用保護性B細胞表位肽為抗原靶向性制備Stx2中和性抗體的第一步。本部分研究是首先在NCBI的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫檢索EHECO157:H7的Stx2以及Stx2與配體腺嘌呤復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析圖。基于Stx2與配體腺嘌呤相互作用的立體結(jié)構(gòu)，依據(jù)B表位肽的預(yù)測原則，選取Stx2 A1毒性片段上的4條氨基酸肽段，采用DNAStar軟件對預(yù)測的4條氨基酸肽段進行親水性、表面可及性、可塑性、二級結(jié)構(gòu)抗原性等參數(shù)進行評價，通過BLAST檢索

3、比較被預(yù)選B細胞表位肽與人、兔、鼠的同源性后，最終確定本研究所用的4條可能的B表位多肽序列，分別為Pl、P2、P3、P4人工合成4條B表位肽，并且均偶聯(lián)載體蛋白鑰孔戚血藍素后分別免疫日本大耳兔，鑒定其免疫原性，間接ELISA結(jié)果顯示：4條合成多肽均能刺激日本大耳兔產(chǎn)生抗多肽和天然Stx2的抗體，抗血清與天然Stx2反應(yīng)的效價P2>P1>P3>P4；Dot ELISA結(jié)果顯示：4條B細胞表位肽制備的兔多克隆抗體能特異的與B細胞表位肽、St

4、x2和載體蛋白KLH反應(yīng)；Western blot結(jié)果顯示：4條B細胞表位肽誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異針對Stx2 A亞單位的多克隆抗體，以上結(jié)果表明預(yù)測的4條多肽具有免疫原性，能刺激機體產(chǎn)生特異的抗Stx2A亞單位的抗體，確為B細胞表位肽。用4條B細胞表位肽免疫Balb/c小鼠后，以天然Stx2攻毒，篩選出的P1多肽為保護性B細胞表位肽，該表位肽包括Stx2毒性活性位點即位于Stx2 A1片段的第77位氨基酸-酪氨酸，為靶向Stx2毒素活性中心

5、的中和性單克隆抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。 第二部分基于EHEC O157：H7 Stx2 B細胞表位肽的中和性MAb制備與生物學(xué)鑒定 本部分研究是在第一部分成功獲得包含Stx2毒性活性中心的P1保護性B細胞表位肽的基礎(chǔ)上，靶向性制備抗Stx2中和性單克隆抗體，并對單抗的生物學(xué)活性進行了鑒定。首先，以偶聯(lián)載體蛋白KLH的P1保護性B細胞表位肽為免疫原，在應(yīng)用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用含HAT的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基和以天然

6、Stx2為篩選抗原的間接ELISA方法，快速篩選針對Stx2的單克隆雜交瘤細胞株。結(jié)果從1700個單克隆雜交瘤細胞中篩選出7株穩(wěn)定分泌抗天然Stx2的單克隆雜交瘤細胞株，染色體核型鑒定結(jié)果顯示：1F2、18C3、1G1和6834株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目分別為106、100、98和104，接近小鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞染色體數(shù)目的總和，說明1F2、18C3、1G1和6834株雜交瘤細胞為小鼠脾細胞與Sp2/0細胞的融合體。而9D7、

7、8D4和11D3的染色體數(shù)目分別140、144和142，比小鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞染色體數(shù)目的總和約多40條，與2個脾細胞與1個SP2/0細胞的三倍體雜交瘤細胞的染色體數(shù)目相似；Dot-ELISA和Western Blot鑒定結(jié)果顯示：1F2、18C3、1G1、6834株單抗為Stx2 A亞單位特異的單克隆抗體，而8D4、11D3、9D73株單抗與KLH有交叉反應(yīng)，結(jié)合3株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目為三倍體的結(jié)果，推測其原因可能是一

8、個單克隆細胞株融合了針對Stx2和KLH兩種抗原決定簇的B淋巴細胞染色體；單克隆抗體的亞類鑒定結(jié)果顯示：1F2、386、1G1和18C34株天然Stx2特異的單克隆抗體均屬于IgG1κ型：1F2、386、1G1和18C34株單抗的抗體親和力常數(shù)鑒定結(jié)果分別為1.7×10-9、6.3×10-8、5.7×10-7和9×10-7。 體外細胞毒阻斷試驗表明1F2、18C3、1G1和6834株單克隆均有中和Stx2的作用，4株單抗中和作用

9、相比：1F2>18C3>1G1=683；同時高劑量的單抗具有明顯的預(yù)防保護作用；體外單克隆抗體治療保護試驗研究顯示：1F2和18C3的高劑量組有一定的治療保護作用，而且加入抗體越早中和作用越明顯，一旦毒素與細胞結(jié)合則抗體不能發(fā)揮保護作用，同時結(jié)果顯示1G1和683沒有明顯的治療保護作用，其原因可能與2株抗體的親和力較低有關(guān)。此外，P1B細胞表位肽體外競爭抑制1F2單克隆抗體對Stx2毒性中和作用試驗結(jié)果表明：P1B細胞表位肽與Stx2具

10、有相同的毒性活性表位，因此本研究選用體外實驗證明預(yù)防保護作用最強的1F2單抗作為動物體內(nèi)保護作用研究的對象。 本部分研究表明：制備的抗Stx2毒性活性中心的單克隆抗體1F2具有高特異性、高親和力，在動物體內(nèi)能有效中和Stx2毒素，具有良好預(yù)防和治療作用。為臨床上使用抗Stx2的特異性抗體治療EHEC O157：H7感染，預(yù)防HUS和TTP等并發(fā)癥的出現(xiàn)，提供了可能。 第三部分 EHEC O157：H7 Stx2中和性Fa

11、b抗體的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析 鼠源性單克隆抗體的異源性，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用，本部分研究采用基因工程技術(shù)將1F2中和性單抗改造成Fab基因工程抗體。首先從分泌抗Stx2毒性活性中心的中和性單克隆抗體雜交瘤細胞株1F2中提取總RNA，以提取的總RNA為模板，采用One step PT-PCR試劑盒，以根據(jù)鼠免疫球蛋白不同家族的可變區(qū)基因序列設(shè)計的7對K輕鏈引物和8對IgG1重鏈Fd片段引物，分別擴增1F2抗體的K輕鏈和Fd片段

12、基因，將釣取的抗體κ鏈和Fd鏈基因構(gòu)建至Fab抗體表達載體Pcomb3X，并切除Pcomb3X載體上的噬菌體外殼蛋白III的基因后，轉(zhuǎn)化XL-Blue菌。 本部分研究成功構(gòu)建了1F2Fab抗體的表達載體，基因測序結(jié)果顯示：1F2Fab抗體的κ鏈為648bp，F(xiàn)d1鏈為636bp，采用生物信息學(xué)方法對所得Fab抗體序列與現(xiàn)有已報道的其它各種抗體基因進行同源性比較，分析其胚系基因來源，結(jié)果κ鏈基因序列與鼠抗體的κ鏈的胚系基因以及Fd

13、鏈基因序列和鼠抗體重鏈的胚系基因具有較高的一致性，分別為92％和87％，且和現(xiàn)有報道的各種其它已知抗體基因序列均不完全一致。說明1F2Fab抗體的基因的確來自小鼠胚系基因。根據(jù)1F2Fab抗體基因序列，經(jīng)計算機軟件推導(dǎo)出編碼1F2Fab抗體的Fd鏈編碼212個氨基酸，分子量為22436.31Da；1F2Fab抗體的κ編碼216個氨基酸，分子量為23882.52Da。將1F2Fab抗體的氨基酸序列提交SWISS-MODEL在線工具，經(jīng)分子

14、模建對其三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測并提交PDB數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示：1F2Fab抗體的Fd鏈具有鼠Fab抗體重鏈結(jié)構(gòu)特征，可變區(qū)位于1-108位氨基酸；1F2Fab抗體的κ鏈具有鼠Fab抗體輕鏈結(jié)構(gòu)特征，可變區(qū)位于1～106位氨基酸。Fd鏈的cDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域分別為20aa～27aa、45aa～52aa和91a～100aa；κ鏈的CDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域分別為24aa～34aa，52aa～54aa和91aa～98aa。F

15、d鏈氨基酸序列的第16、90、137、192、212位氨基酸和κ鏈氨基酸序列的第21、91、137、197、216位氨基酸均為半胱氨酸，可以形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵。 第四部分EHEC O157：H7 Stx2中和性Fab抗體的可溶表達及生物學(xué)功能研究 本研究將Pcomb3X-1F2Fab重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL-blue工程菌，30℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)14h，收集誘導(dǎo)后重組工程菌超聲破菌上清。間接ELlSA檢測重組工程菌超聲破菌上清

16、，出現(xiàn)陽性結(jié)果；SDS-PAGE檢測顯示：在Mr約為23KDa處出現(xiàn)1條新的蛋白表達帶，與1F2Fabκ鏈和Fd鏈預(yù)測的分子量相近，說明重組子Pcomb3-1F2Fab/XL-blue在IPTG的誘導(dǎo)下能分泌性表達具有與天然Stx2特異結(jié)合的1F2Fab抗體，但凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果顯示1F2Fab抗體的表達量低，約為2％。采用Protein L Resin抗體親和層析柱純化1F2Fab抗體，純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE后，采用凝

17、膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白純度為95％。Western blot結(jié)果表明，純化后的1F2Fab抗體能與相應(yīng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的天然Stx2 A亞單位蛋白在32KDa處形成單一的蛋白質(zhì)染色帶；競爭ELISA檢測結(jié)果表明，1F2Fab抗體能與親本鼠單抗1F2競爭性結(jié)合同一抗原表位，且競爭作用隨著抗體濃度增加而加強。根據(jù)50％抑制率時1F2Fab與親本鼠單抗1F2抗體濃度的比值，可計算出1F2Fab的親和力為親本鼠單抗1F2的85％。間接E