出血性大腸桿菌(EHEC)O157-H7效應蛋白NleL和宿主蛋白ZBED1相互作用的發(fā)現(xiàn)與驗證.pdf

1、出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7是一種食源性和水源性的病原菌,該菌通過III型分泌系統(tǒng)將效應蛋白注入至宿主細胞中產(chǎn)生粘附與脫落(A/E)損傷而致病,它的感染會導致出血性腸炎并極有可能出現(xiàn)致命的出血性尿毒綜合癥,是一種全球范圍內(nèi)高度關注的病原菌。NleL(non-lee-encoded-effector-Ligase)是由Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一種具有真核細胞泛素化E3連接酶活性的效應蛋白,然而它在宿主細胞內(nèi)的底物和作用機制尚不清楚。

2、
　　本文通過蛋白質表達重組子的構建、蛋白質的誘導表達與純化、蛋白質細胞內(nèi)定位、酵母雙雜交、GST pull-down和體外泛素化等實驗方法來篩選和驗證效應蛋白NleL在真核細胞內(nèi)的相互作用蛋白,取得了以下結果:
　　1.酵母雙雜交實驗篩選NleL可能作用于宿主的底物蛋白ZBED1
　　酵母雙雜交實驗初次篩選出可能與效應蛋白NleL相互作用的真核宿主細胞蛋白ZBED1,在SD-2和SD-4板均能生長的陽性克隆,經(jīng)擴增、

3、雙酶切、測序分析比對后,發(fā)現(xiàn)的確是ZBED1序列,可初步推斷宿主蛋白ZBED1與效應蛋白NleL之間有可能存在相互作用。
　　2. NleL(GST-NleL)蛋白的誘導表達與純化
　　本研究成功純化了帶有 GST和 His雙標簽的 NleL的全長蛋白GST-NleL-His和其帶單標簽的片段 GST-NleL170-782-WT蛋白。結果表明,在純化方法上用GST-beads純化方法優(yōu)于用Ni-NTA方法;純化獲得的Nle

4、L融合蛋白的純度和質量也滿足進一步實驗的要求,融合蛋白可以冷凍儲存為后續(xù)體外實驗備用。
　　3.效應蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1結合試驗
　　用GST pulldown試驗驗證了宿主蛋白ZBED1與效應蛋白NleL的相互結合, western blot檢測顯示蛋白 GST-NleL-His與 NleL蛋白的片段GST-NleL170-782WT都與宿主蛋白ZBED1在體外產(chǎn)生較強的相互結合,由ZBED1與GST-NleL

5、170-782WT的相互結合可以推測:效應蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1相互結合的位點有可能位于第170-782氨基殘基之間。
　　4.效應蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1的體外泛素化試驗
　　已有研究顯示NleL具E3連接酶活性,且其泛素化的活性與第753位的半胱氨酸殘基有關,本研究通過NleL與ZBED1體外泛素化實驗探究了NleL是否通過該活性作用于底物ZBED1。結果表明,宿主蛋白ZBED1存在自泛素化現(xiàn)象,Nle

6、L全長蛋白融合蛋白GST-NleL-His、NleL的第753位點突變片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A與底物ZBED1蛋白相互作用后,ZBED1的自泛素化作用明顯減弱,效應蛋白 NleL可能是通過影響宿主蛋白 ZBED1的自泛素化作用而影響宿主細胞的生理活動;NleL的第753位點突變片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A與未突變的全長蛋白作用效果相同,表明NleL蛋白不是通過E3連接酶的活性來影響ZB

7、ED1的生理作用的。
　　5.效應蛋白NleL在真核細胞內(nèi)的表達與定位
　　明確效應蛋白NleL在細胞內(nèi)的定位對于探究其在真核細胞中的作用機制是十分必要的。本研究成功構建出能夠在真核細胞中表達帶EGFP的NleL融合蛋白重組質粒 pCDNA3.0-UTR-EGFP-NleL-HA,將該質粒和對照質粒pCDNA3.0-UTR-EGFP-HA轉染293T和Hela細胞后,觀察顯示NleL蛋白絕大多數(shù)定位在細胞質內(nèi),亦有少量進入到

8、細胞核中;對照組EGFP熒光蛋白在整個細胞中均有分布,沒有明顯的細胞定位特異性。由此可推測,NleL效應蛋白進入真核細胞后,可能在細胞質中和細胞核中與不同的底物蛋白發(fā)揮不同的作用。
　　總之,本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)首次成功篩選到效應蛋白NleL在宿主細胞中的潛在底物ZBED1,并且通過GST pull-down試驗和與體外泛素化試驗初步探討了 NleL蛋白的相互作用,并明確了 NleL蛋白在真核細胞內(nèi)的定位,為今后進一步探究該蛋