魚(yú)類紅細(xì)胞和蝦類血淋巴細(xì)胞的免疫特性和抗菌機(jī)理研究.pdf

1、魚(yú)蝦類是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物。魚(yú)蝦類基礎(chǔ)免疫的研究，對(duì)開(kāi)展其疾病的高效防控具有重要意義。紅細(xì)胞和血淋巴分別是魚(yú)類和蝦類氧氣運(yùn)輸?shù)墓ぞ?，這些呼吸蛋白可以攜帶和運(yùn)輸氧氣到生物體各個(gè)組織。魚(yú)類的呼吸蛋白是血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，蝦類的呼吸蛋白是血藍(lán)蛋白(hemocyanin，Hc)。除了呼吸作用之外，近年來(lái)魚(yú)類紅細(xì)胞和蝦類血淋巴細(xì)胞的免疫功能和抗感染活性越來(lái)越受重視。本研究以草魚(yú)、克氏原螯蝦和南美白對(duì)蝦三種重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)

2、物為研究對(duì)象，對(duì)紅細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞以及血藍(lán)蛋白在免疫功能和抗菌機(jī)理方面進(jìn)行研究，主要結(jié)果如下:
　　1、草魚(yú)紅細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬活性。將草魚(yú)紅細(xì)胞分別與FITC標(biāo)記后的嗜水氣單胞菌和金色葡萄球菌進(jìn)行孵育，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞對(duì)兩種細(xì)菌都有粘附作用。掃描電鏡結(jié)果顯示，紅細(xì)胞不僅可以對(duì)細(xì)菌有粘附功能，也可以伸出絲狀偽足捕獲細(xì)菌。共聚焦、透射電鏡和掃描電鏡等結(jié)果顯示紅細(xì)胞對(duì)多種細(xì)菌有廣泛的吞噬活性。
　　2、草魚(yú)紅細(xì)胞的抗菌機(jī)

3、理。草魚(yú)紅細(xì)胞與嗜水氣單胞菌孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象的發(fā)生，同時(shí)紅細(xì)胞通過(guò)釋放活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出廣泛的殺傷作用。為了進(jìn)一步探究其ROS的來(lái)源，我們發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞內(nèi)存在的NADPH酶并不參與紅細(xì)胞ROS的調(diào)控作用。血紅蛋白在空氣中快速自氧化并產(chǎn)生高水平的ROS和高價(jià)鐵離子。細(xì)菌來(lái)源的蛋白酶和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可以協(xié)同促進(jìn)血紅蛋白的水解

4、，并促進(jìn)ROS的釋放，并對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺傷作用。
　　3、草魚(yú)巨噬細(xì)胞對(duì)血紅蛋白的清除機(jī)理。細(xì)菌感染導(dǎo)致紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白，從而釋放ROS殺傷入侵的細(xì)菌，但是過(guò)多的ROS對(duì)機(jī)體也有毒性作用，因此機(jī)體需要對(duì)其進(jìn)行清除。將草魚(yú)的血紅蛋白和紅細(xì)胞注射到草魚(yú)體內(nèi)后，伴隨著血清中血紅蛋白含量的升高，其抗氧化酶快速上調(diào)，表明血清可以清除多余的血紅蛋白。過(guò)多的血紅蛋白也可以造成頭腎的組織壞死，同時(shí)頭腎也參與了對(duì)血紅蛋白的清除。實(shí)驗(yàn)表明頭腎

5、中的巨噬細(xì)胞可吞噬血紅蛋白，同時(shí)血紅蛋白釋放的ROS也可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步研究其機(jī)制，將50μg/ml和2mg/ml的血紅蛋白孵育巨噬細(xì)胞12h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，兩種劑量血紅蛋白的刺激，獲得的差異表達(dá)基因分別是2853個(gè)(1800個(gè)上調(diào)，1053個(gè)基因下調(diào))和3582個(gè)（2171個(gè)上調(diào)和1411個(gè)下調(diào)）。在這些差異表達(dá)中，分別有30和29個(gè)細(xì)胞因子基因，主要有趨化因子、炎癥因子等。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)確認(rèn)

6、了這些細(xì)胞因子表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組基本一致。以上結(jié)果集中表明，巨噬細(xì)胞在清除血紅蛋白的同時(shí)，血紅蛋白也可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和釋放細(xì)胞因子。
　　4、克氏原螯蝦血藍(lán)蛋白的抗菌機(jī)制。通過(guò)金色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激克氏原螯蝦，血藍(lán)蛋白的mRNA水平顯著上調(diào)，說(shuō)明血藍(lán)蛋白參與了細(xì)菌入侵的免疫應(yīng)答過(guò)程。通過(guò)原核表達(dá)獲得了全長(zhǎng)血藍(lán)蛋白(PcHMC)及血藍(lán)蛋白的三個(gè)結(jié)構(gòu)域(rPcHMC1-T和rPcHMC1-C，rPcHMC1-N)。細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

7、PcHMC和三個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以與細(xì)菌相結(jié)合;LPS結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示PcHMC和三個(gè)結(jié)構(gòu)域可以與兩種細(xì)菌來(lái)源的LPS相結(jié)合;細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PcHMC和三個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌?xì)菌凝集作用有差異。除了rPcHMC1-N外，PcHMC、rPcHMC1-T和rPcHMC1-C對(duì)金色葡萄球菌的抑制生長(zhǎng)作用顯著;在副溶血弧菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，PcHMC和三個(gè)結(jié)構(gòu)域都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑菌效果;在酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活性測(cè)試中，rPcHM

8、C1-T釋放的PO活性顯著高于另外兩個(gè)結(jié)構(gòu)域;血細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)中除了rPcHMC1-T外，PcHMC、rPcHMC1-N和rPcHMC1-C對(duì)金色葡萄球菌和副溶血弧菌都有顯著的促進(jìn)血細(xì)胞吞噬的功能。上述結(jié)果表明，克氏原螯蝦的血藍(lán)蛋白具有結(jié)合、凝集和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的活性，也可以通過(guò)釋放PO活性和促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬進(jìn)行抗菌活性。血藍(lán)蛋白的三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域在抗細(xì)菌活性中存在差異。
　　5、南美白對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞抗副溶血弧菌感染的機(jī)制。將副溶血弧菌

9、和PBS注射到南美白對(duì)蝦體內(nèi)，12h后采集蝦的血細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)定。一共獲得了2258個(gè)差異基因，其中1017個(gè)基因上調(diào)，1241個(gè)基因顯著下調(diào)。并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到5個(gè)可能直接參與免疫應(yīng)答的基因，分別是MNK1/2MAP激酶相互作用絲氨酸(MNK)，C型凝集素3(CTL3)，清道夫受體B1(SR)，γ-干擾素誘導(dǎo)型溶酶體巰基還原酶(GILT)和抗脂多糖因子樣蛋白(ALFP)。通過(guò)基因敲降方法對(duì)這5個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步研究，結(jié)果表明它們