中國明對蝦血藍蛋白的組織分布特點及白斑癥病毒感染后血藍蛋白含量的變化.pdf

1、本論文應(yīng)用抗中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血藍蛋白單克隆抗體,研究血藍蛋白在中國明對蝦鰓、心、胃、中腸、淋巴器官、卵巢和肝胰臟等組織器官中的分布特點;用不同濃度白斑癥病毒(WSSV)感染中國明對蝦,測定血淋巴中血藍蛋白和總蛋白含量的變化。旨在為血藍蛋白抗WSSV感染免疫作用機制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。主要包括以下3部分:
　　1.抗中國明對蝦血藍蛋白單克隆抗體的特性分析及抗原抗體最佳使用稀釋度的確定

2、r>　　復(fù)蘇抗中國對蝦血藍蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株2H3,收集細胞培養(yǎng)上清,以中國明對蝦血淋巴上清液為抗原,用Western-blotting法對單抗2H3進行特性分析,并通過棋盤法滴定法確定酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)中抗原抗體最佳稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明:單抗2H3可與中國對蝦血藍蛋白的分子量分別為73 kDa和75 kDa的兩個亞基發(fā)生特異性反應(yīng);ELISA中抗原抗體的最佳使用稀釋倍數(shù)分別為10-4和2-2。
　　2.中國明對

3、蝦血藍蛋白的組織分布特點
　　以篩選出的單抗2H3為第一抗體,采用石蠟切片、免疫組化方法,研究血藍蛋白在中國明對蝦鰓、心、胃、中腸、淋巴器官、卵巢和肝胰臟等組織器官中的分布特點。結(jié)果表明:血藍蛋白在各組織器官中均有分布,在鰓絲小葉邊緣的微血腔、心肌束間隙、淋巴器官的淋巴腔中以及肝小管中陽性信號較強:在卵巢卵母細胞之間的血竇、胃內(nèi)壁環(huán)肌層結(jié)締組織的血竇和中腸結(jié)締組織血竇中有陽性信號。結(jié)論認為,中國明對蝦血藍蛋白陽性信號大多來自血淋巴

4、而非實質(zhì)組織,且在血淋巴含量多、血流量大的部位含量豐富,在某些血淋巴無法到達的部位(肝小管內(nèi)壁等)也有血藍蛋白分布,血藍蛋白含量的這種組織特異性與各組織器官的功能有著密切的聯(lián)系。
　　3.白斑癥病毒感染后中國明對蝦血藍蛋白含量的變化
　　取患白斑癥的螯蝦鰓,每克鰓組織加10 ml磷酸緩沖液勻漿,離心、過濾后以濾液為病毒粗提母液,稀釋至10-2,10-4和10-6作為WSSV注射液,注射感染中國明對蝦,繪制存活率曲線。實驗證明

5、以10-2、10-4和10-6這三個病毒稀釋度感染中國明對蝦,不僅可以保證實驗動物均被成功感染上病毒,也可以保證實驗過程中不同時間段均有足夠的存活對蝦可供取樣。
　　分別以10-2,10-4和10-6 WSSV粗提液尾節(jié)肌肉注射感染中國明對蝦,分別在感染后0 h,6 h,12 h,24 h,36 h,48 h和72 h取樣。
　　取對蝦鰓組織,two-step PCR檢測WSSV。10-2 WSSV感染組在WSSV感染后12

6、 h于鰓中檢出病毒,10-4 WSSV感染組在感染后12 h被第二步PCR檢出病毒,10-6 WSSV感染組在感染后24 h被第二步PCR檢出病毒。
　　抽取血淋巴,ELISA測定血藍蛋白的含量。結(jié)果顯示,在10-22WSSV感染組,感染后6 h血藍蛋白含量顯著上升(A405nm=0.74±0.036,ANOVA,p＜0.05)并在12 h達到最高值(A405nm=0.77±0.047,ANOVA,p＜0.05),在24 h降至對

7、照水平,隨后持續(xù)下降并顯著低于對照組,直到72 h達到最低值(A405nm=0.18±0.046,ANOVA,p＜0.05)。在10-4和10-6WSSV感染組,血藍蛋白含量在感染后0 h,6 h,12 h和24 h無顯著變化,從36 h起顯著低于對照組,持續(xù)下降至72 h達到最低(10-4:A405nm=0.23±0.053:10-6:A405nm=0.22±0.050,ANOVA,p＜0.05)。
　　考染法測定血淋巴總蛋白的

8、含量。結(jié)果顯示,在10-2,10-4和10-6 WSSV感染組中,血淋巴總蛋白含量均在感染W(wǎng)SSV后6 h顯著高于對照組,并在12 h達到最大值(10-2:108.18±1.36 mg/ml;10-4:103.49±1.33 mg/ml;10-6:96.94±1.06 mg/ml,ANOVA,p＜0.05),在72 h顯著低于對照組(10-2:86.95±0.52 mg/ml;10-4:89.27±0.76 mg/ml;10-6:85.