稻瘟病菌細胞自噬相關(guān)基因MgATG4表達模式與功能分析.pdf

1、細胞自噬是真核生物中高度保守的過程，在此過程中，包括過剩或異常的細胞器在內(nèi)的細胞物質(zhì)被包裹進雙層膜的自噬泡中并被運輸?shù)饺苊阁w或液泡中進行降解，從而使得生物大分子得以重新利用。細胞自噬在諸如對變化環(huán)境的適應(yīng)、發(fā)育與分化過程中細胞形態(tài)的建成以及細胞壽命的決定等一系列生物事件中起著重要作用。細胞自噬相關(guān)基因最早在酵母中被鑒定，如今在所有的高等生物中已發(fā)現(xiàn)其同源基因。細胞自噬可由饑餓誘導產(chǎn)生并維持一個氨基酸庫以便合成一些必需的蛋白質(zhì)。
　

2、　 稻瘟病是一種由稻瘟病菌引起的毀滅性病害，給全世界的水稻生產(chǎn)帶來巨大威脅。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有典型的生活史和侵染循環(huán)，且被認為是絲狀真菌分子生物學和病原菌與寄主互作研究的模式生物。稻瘟病菌能夠形成專門的侵染結(jié)構(gòu)—附著胞，其能夠產(chǎn)生巨大的胞內(nèi)膨壓(約8.0Mpa)，這個壓力使稻瘟病菌穿透植物葉片表皮并侵染寄主。
　　 本研究主要目的是闡明細胞自噬相關(guān)基因MgATG4的表達模式，細胞自噬與稻瘟病菌

3、生長、發(fā)育和致病性之間的關(guān)系以及細胞自噬相關(guān)蛋白MgATG4與MgATG8之間的相互作用。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 從稻瘟病菌成熟附著胞的差減文庫中克隆到了細胞自噬相關(guān)基因MgATG4，該基因編碼一個53.93kDa的半胱氨酸蛋白酶。將稻瘟病菌MgATG4基因，互補到酵母ATG4基因缺失突變體中，能夠恢復酵母的細胞自噬過程；對MgATG4進行時間表達模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在孢子、附著胞及菌絲中均有表達；細胞定位分析發(fā)現(xiàn)MgA

4、TG4蛋白在細胞質(zhì)中均勻表達。
　　 通過構(gòu)建MgATG4基因置換載體，得到MgATG4基因缺失突變體△mgatg4?！鱩gatg4突變體在CM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)發(fā)生變化，菌絲稀疏；產(chǎn)孢量顯著下降，約為野生型Guyll的1/90；分生孢子的萌發(fā)及附著胞形成延遲；附著胞膨壓顯著下降，在完整的水稻或者大麥葉片上不能形成可見病斑，致病性喪失；在有磨損的大麥葉片上也未能產(chǎn)生病斑；突變子在OMA培養(yǎng)基上與2539菌株交配，能產(chǎn)生-了囊殼，

5、但延遲且量極少；基因MgATG4的缺失，使細胞自噬過程中斷，液泡和細胞質(zhì)中無自噬泡的積累。
　　 從稻瘟病菌成熟附著胞的差減文庫中克隆得到了另一個細胞自噬相關(guān)基因MgATG8，該基因編碼一個14.4kDa的ATG8蛋白。對MgATG8進行時間表達模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在孢子、附著胞及菌絲中均有表達。通過雙分子熒光互補技術(shù)檢測MgATG4與MgATG8在稻瘟病菌細胞發(fā)育過程中的相互作用，分別構(gòu)建BiFC載體ATG4-YFPN、ATG

6、4△-YFPN和YFPC-ATG8共轉(zhuǎn)化稻瘟病菌Guyll菌株并用潮霉素和草胺磷雙抗篩選。轉(zhuǎn)化子BY-7經(jīng)共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在孢子、營養(yǎng)菌絲、附著胞形成過程及穿透過程中均沒有檢測到Y(jié)FP熒光信號，但在饑餓誘導4h后的菌絲中檢測到了MgATG4與MgATG8的相互作用。
　　 MgATG4蛋白序列中含有6個半胱氨酸殘基。通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)MgATG4蛋白序列中的Cys206為保守半胱氨酸；分別構(gòu)建MgATG4、MgATG