紅笛鯛CD40基因克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國(guó)及東南亞重要的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖密度的增加及養(yǎng)殖水體的惡化，導(dǎo)致多種病原菌的爆發(fā)，對(duì)紅笛鯛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。CD40分子是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor, TNFR）超家族成員，屬于I型跨膜糖蛋白。CD40分子在B細(xì)胞的活化、分化、Ig的分泌及類(lèi)型轉(zhuǎn)換，T細(xì)胞的激發(fā)、定向分化，抗原呈遞細(xì)胞的

2、激發(fā)、分化及功能調(diào)節(jié)，以及參與信號(hào)傳導(dǎo)等方面起關(guān)鍵作用。而CD40分子執(zhí)行生物學(xué)效應(yīng)的前提條件是，通過(guò)CD40與CD40配體（CD40L）結(jié)合后組成的共刺激途徑來(lái)影響免疫應(yīng)答。CD40與 CD40L是體內(nèi)炎癥和免疫反應(yīng)系統(tǒng)的一對(duì)共刺激因子，參與機(jī)體內(nèi)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前，對(duì)CD40基因在免疫系統(tǒng)應(yīng)答中的作用研究主要集中在哺乳動(dòng)物，在硬骨魚(yú)中極為鮮見(jiàn)。為了研究外界病原菌感染紅笛鯛過(guò)程中，CD40基因在宿主免疫應(yīng)答系統(tǒng)中的作用機(jī)制，我

3、們開(kāi)展了紅笛鯛非特異性免疫基因CD40的分子克隆、表達(dá)特征及功能研究。
　　1.通過(guò)同源克隆及RACE技術(shù)，從紅笛鯛頭腎組織中成功克隆了CD40基因的cDNA全長(zhǎng)，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，結(jié)果表明，紅笛鯛CD40 cDNA序列由2073個(gè)核苷酸組成，完整開(kāi)放閱讀框（ORF）為984 bp，5?非編碼區(qū)（5?-UTR）為69 bp，3?非編碼區(qū)（3?-UTR）為1020 bp，編碼327個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量（MW）為36.28 KD

4、a，理論等電點(diǎn)（pI）為5.38。N端有30 aa的信號(hào)肽序列，在200-222 aa位置存在跨膜結(jié)構(gòu)域。紅笛鯛CD40基因比較保守，具有TNFR家族成員共有的半胱氨酸富含域。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示：紅笛鯛與點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus malabaricus）的親緣關(guān)系較近。
　　2.利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)紅笛鯛CD40基因的組織分布狀況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CD40基因在紅笛鯛各組織中均有表達(dá)，其中在脾臟、頭腎、肝臟

5、、鰓、腦、心臟、胃中表達(dá)量較高，而胸腺、肌肉、腸、皮膚中表達(dá)量較少。應(yīng)用Real-Time PCR檢測(cè)在哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、poly I:C、LPS分別刺激紅笛鯛和紅笛鯛頭腎細(xì)胞后，不同時(shí)間內(nèi)CD40基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，紅笛鯛分別經(jīng)哈維氏弧菌、poly I:C刺激后，CD40在頭腎、胸腺、脾臟、肝臟、腸、鰓、肌肉組織中的表達(dá)量均上調(diào)且表達(dá)模式相似。0~84 h內(nèi)，隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，CD40基因的表達(dá)量在上述

6、組織中達(dá)到峰值的時(shí)間不同。Poly I:C、LPS刺激紅笛鯛頭腎白細(xì)胞后，結(jié)果顯示，CD40基因在細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，在孵育細(xì)胞12 h后達(dá)到峰值，且經(jīng)LPS孵育后CD40的表達(dá)量高于poly I:C的孵育結(jié)果。
　　3.構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32-CD40、pET32-△CD40和pET32-△△CD40，分別表達(dá)CD40基因全長(zhǎng)cDNA、去信號(hào)肽基因cDNA片段和胞外段基因cDNA片段，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)體系，三個(gè)重組融合蛋白的最

7、優(yōu)表達(dá)條件分別是：37℃下，0.08 mmol.L-1 IPTG，OD600=0.4，誘導(dǎo)5 h；37℃下，0.1 mmol.L-1 IPTG，OD600=0.6，誘導(dǎo)6 h；37℃下，0.06 mmol.L-1 IPTG，OD600=0.6，誘導(dǎo)6 h。均以包涵體形式存在。對(duì)pET32-△△CD40重組蛋白進(jìn)行純化，Western blot分析發(fā)現(xiàn)CD40胞外段融合蛋白能夠與鼠抗His-Tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明目的蛋白得以

8、成功表達(dá)。通過(guò)對(duì)重組載體pET32-CD40、pET32-△CD40分別在最優(yōu)條件誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，pET32-△CD40的表達(dá)量高于pET32-CD40。
　　4.用純化后的pET32-△△CD40重組蛋白，免疫小鼠，制備了高效特異的鼠抗紅笛鯛CD40多克隆抗體。同時(shí)利用制備的多克隆抗體對(duì)紅笛鯛胸腺、頭腎及脾臟組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果顯示，CD40主要分布于上述器官的淋巴細(xì)胞中。采用CD40抗血清進(jìn)行體外抗體中和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明