長葉紅砂胚胎晚期富集蛋白RtLEA基因的克隆及功能分析.pdf

1、長葉紅砂（Reaumuria trigyna），隸屬檉柳科(Tamaricaceae)琵琶柴屬(Reaumuria Linn.)，是亞洲中部區(qū)東阿拉善-西鄂爾多斯特有種，屬我國特有，被列為內蒙古自治區(qū)珍稀瀕危植物。該植物對鹽漬環(huán)境具有極強適應性，能夠在高鹽環(huán)境下完成其生活史。胚胎晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant protein，LEA)是植物胚胎發(fā)育后期在胚胎中大量表達的一類蛋白。它廣泛的存在于植物體

2、中，表達量受發(fā)育階段、脫水信號和脫落酸(ABA)的調節(jié)。在植物抵御高鹽、干旱等逆境時發(fā)揮著重要的作用。
　　本實驗運用RT-PCR和RACE技術克隆了編碼長葉紅砂LEA蛋白基因(RtLEA)的全長cDNA序列，該基因全長765bp，包含一個315bp的開放閱讀框，編碼一個由104個氨基酸組成的蛋白，預測分子量為11.282kDa，等電點為7.92。長葉紅砂RtLEA蛋白擁有第五組LEA家族蛋白的特有序列W(A/V)PDP(V/I)

3、TGYYRP。該蛋白含有LEA蛋白的保守結構域pfam LEA-3，根據Battaglia的LEA蛋白分類標準，屬于Group5B。系統(tǒng)進化分析顯示長葉紅砂RtLEA蛋白與檉柳（檉柳科，檉柳屬）LEA蛋白的親緣關系最近。
　　半定量RT-PCR分析結果表明， RtLEA基因的表達受鹽、干旱、低溫、ABA的誘導。利用Sitefinding PCR克隆了該基因的啟動子區(qū)，序列分析結果顯示RtLEA基因5'上游調控區(qū)含有響應鹽、干旱、低

4、溫、ABA等非生物脅迫的順式作用元件，并且有兩個胚乳特異表達元件。
　　為了研究RtLEA基因的異源表達特性，構建了RtLEA基因的原核表達載體PET-32a-RtLEA。對大腸桿菌表達菌株Rosetta進行轉化與誘導表達，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到了與預期大小一致的融合蛋白。RtLEA蛋白提高了重組菌對高鹽、滲透、高溫、低溫、ABA等非生物脅迫的耐受性。初步證明長葉紅砂RtLEA蛋白具有多重抗逆功能。
　　克隆了Rt