朵麗蝶蘭成花相關(guān)基因DhEFL4基因和啟動(dòng)子的分離與功能驗(yàn)證.pdf

1、朵麗蝶蘭(Doritaenopsis)由蝴蝶蘭(Phalaenopsis)與朵麗蘭(Doritis)雜交而成屬于廣義上的蝴蝶蘭,由于其花色艷麗,花期持久,因而深受消費(fèi)者歡迎,市場(chǎng)占有率高,具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　本研究通過(guò)在Hong-Hwa Chen建立的OrchidBase的cDNA文庫(kù)中的EST序列進(jìn)行比對(duì)分析,篩選出兩個(gè)與玉米(Zea mays)中EFL4同源性很高的序列,以出瓶7個(gè)月左右的朵麗蝶蘭‘Tinny

2、Tender’(Doritaenopsis Happy smile×Happy valentine)克隆苗為試材,利用RACE技術(shù)分離基因的cDNA序列,并通過(guò)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。同時(shí)利用染色體步移技術(shù)獲得DhEFL4啟動(dòng)子序列。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用RACE的方法克隆到了朵麗蝶蘭中DhEFL4基因的cDNA序列,其中,獲得了DhEFL4基因的cDNA序列593bp bp,含有一個(gè)345 bp的ORF區(qū),編碼114

3、個(gè)氨基酸。
　　2、通過(guò)由處于光照進(jìn)入黑暗時(shí)分朵麗蝶蘭的根、莖、葉、花梗、花蕾及花器官(花瓣、萼片、唇瓣和蕊柱)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,發(fā)現(xiàn)花蕾的表達(dá)量最高,說(shuō)明DhEFL4和朵麗蝶蘭成花相關(guān)。同時(shí)分別采集短日照和長(zhǎng)日照處理?xiàng)l件下朵麗蝶蘭的葉片(一晝夜中每隔兩小時(shí)采集一次),將長(zhǎng)日照和短日照的葉片分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,建立了DhEFL4基因的晝夜節(jié)律,結(jié)果顯示DhEFL4基因具備明顯又規(guī)律的晝夜節(jié)律性,而且長(zhǎng)、短日照下的表達(dá)規(guī)律不同

4、,說(shuō)明日照時(shí)間還是會(huì)影響到朵麗蝶蘭的成花,即使朵麗蝶蘭是光鈍感植物。
　　3、以pCAMBIA1301為植物表達(dá)載體,pMD20-T為中間載體,構(gòu)建了PC1301-DhEFL4正義表達(dá)載體。
　　4、采用蘸花法侵染擬南芥,利用潮霉素篩選純合子并觀察其表型變化,結(jié)果表明,DhEFL4轉(zhuǎn)基因植株的開(kāi)花時(shí)間有很明顯的延遲,并且抽葶數(shù)增加,在DNA和RNA水平上均能檢測(cè)到相應(yīng)基因在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的表達(dá),這一結(jié)果與擬南芥中的報(bào)道基本一