大豆硫轉運蛋白基因GmSULTR12b啟動子的克隆、功能分析及酵母單雜交初步篩選.pdf

1、硫是繼氮、磷、鉀之后第四大植物所必需的營養(yǎng)元素。外界環(huán)境中的SO42-通過植物根系進入植物體內進行還原同化作用，生成一系列重要含硫化學物質。這些含硫有機化合物參與植物體內重要的生理生化反應，對植物的生長發(fā)育以及抵御環(huán)境脅迫起重要作用。SO42-的吸收與轉運是硫進入還原同化途徑中的第一步，也是硫營養(yǎng)代謝的主要調控途徑之一。植物體內硫酸根（SO42-）的吸收與轉運必需借助于硫轉運蛋白(sulfate transporter，SULTR)。硫

2、轉運蛋白參與根系對外界環(huán)境中硫酸根(SO42-)的吸收與轉運。大豆(Glycine max(L.) Merr.)是一種重要的經濟作物，為人類提供豐富的植物性蛋白。大豆蛋白氨基酸組分齊全，但是大豆的含硫氨基酸（Cys和Met）含量很低，限制了其營養(yǎng)價值。對GmSultr1;2b基因功能研究表明，該基因具有硫轉運活性，且在根里特異表達，能夠受到低硫的誘導。在這里，我們希望通過研究GmSultr1;2b基因的啟動子的功能，了解GmSultr1

3、;2b基因調控機制;通過酵母單雜交實驗找出與GmSultr1;2b啟動子互作的蛋白，找到硫代謝及其調控的分子機制，通過基因工程的方法調節(jié)硫代謝途徑中SO42-的分布，為提高含硫氨基酸含量提供理論依據。
　　本研究利用NCBI和Phytozome數據庫中GmSultr1;2b基因序列信息，選取其上游2259bp序列作為候選啟動子。通過在線預測分析啟動子的調控元件發(fā)現該啟動子具有真核生物啟動子必須的核心元件TATA-box外，還含有激

4、素應答元件ERE（乙烯響應元件）、ABRE（脫落酸響應元件）等，脅迫應答元件TC-rich repeats（干旱脅迫以及病蟲害脅迫），AT-rich element（AT-rich的DNA與蛋白結合位點）和MYB等。
　　利用PCR擴增得到啟動子片段，并構建一系列表達載體。利用大豆瞬時表達驗證啟動子的啟動活性，大豆瞬時表達后進行X-gluc染色，結果顯示重組載體侵染的大豆顯藍色，說明GmSULTR1;2b啟動子能夠驅動下游GUS的

5、表達。通過5'端和3'端刪除分析實驗證明預測的啟動子的TSS位點正確。
　　將重組載體p2179+69∷ GUS以及35S∷ GUS轉化大豆，對轉化的大豆毛狀根染色之后，體視鏡下觀察陽性根的橫切面，發(fā)現GUS主要在根毛、根表皮和中柱內表達，表明GmSULTR1;2b啟動子主要在根毛、根表皮和中柱內表達。對轉化的大豆毛狀根進行硫誘導實驗，結果顯示低硫條件下GUS染色加深。為了定量檢測啟動子的驅動活性，對轉化的毛狀根以及硫誘導后的毛狀

6、根進行GUS酶活試驗(GUSactivity），從結果可以看出GmSULTR1;2b啟動子的啟動活性比CaMV35S啟動子的啟動活性弱，硫誘導實驗表明，該啟動子在低硫條件下其GUS活性比其在高硫條件下活性高，說明該啟動子能夠響應低硫誘導，這和GmSULTR1;2b基因的表達情況一致，暗示該啟動子屬于誘導型啟動子。通過酵母單雜交實驗，我們找出幾個可能與GmSULTR1;2b啟動子互作的轉錄因子，這為進一步了解硫調控指出方向，也為后期的進一