甘藍(lán)型油菜線粒體DNA提取及基因表達(dá)分析研究.pdf

1、研究表明植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育( Cytoplasmic Male Sterility， CMS)主要與線粒體基因（Mitochondrial DNA, mtDNA）有關(guān)。本研究摸索建立了高純度線粒體DNA提取純化的技術(shù)體系，分析16個(gè)線粒體基因及1個(gè)線粒體基因片段orf141在甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系H526A及其可育雜交組合的表達(dá)量，為闡明油菜線粒體雄性不育的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)甘藍(lán)型油菜高純度

2、線粒體DNA提取技術(shù)體系的建立：通過比較不同處理對mtDNA得率及質(zhì)量的影響，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，建立了一套高效率高質(zhì)量的線粒體DNA提取體系。取生長7d的甘藍(lán)型油菜幼苗用勻漿器徹底磨碎，勻漿液采用1層紗布粗濾，4層100目的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液。3,000g離心15min，分離破碎組織，17,000g離心15min分離線粒體，收集沉淀。懸浮沉淀，3。000g離心10min，取上清。加入DNaseⅠ室溫酶切30min，后轉(zhuǎn)入4℃酶切1h，加入

3、EDTA終止酶切反應(yīng)。18,000g離心20min富集線粒體，沉淀即為粗制線粒體。選擇蔗糖濃度為1.45M和1.2M的溶液，按照1:1(v/v)的比例鋪制不連續(xù)密度梯度，并將粗制線粒體懸浮在此密度梯度上，72,000g超速離心90min，收集蔗糖分界處的樣品環(huán)帶。將收集的樣品經(jīng)20,000g離心20min,沉淀即為高純度的線粒體。SDS-蛋白酶K裂解后，分離純化mtDNA。通過建庫測序、紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳、酶切驗(yàn)證等手段對提

4、取的mtDNA進(jìn)行濃度和純度分析，表明采用本實(shí)驗(yàn)體系提取的mtDNA質(zhì)量好、純度高，足以滿足后續(xù)的酶切、PCR、基因克隆、基因組測序等后續(xù)分子生物學(xué)研究。
　　 (2)甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的線粒體基因表達(dá)分析：采用由原生質(zhì)體融合雜種不育株培育而得到的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系H526A和其對應(yīng)的可育雜交組合F1,提取其花和蕾的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析表明：orf222基因及其基因片段orf141在不育系H5