花生AhbHLK1參與調控FAD2基因在種子中表達的研究.pdf

1、bHLH轉錄因子是植物轉錄因子中的一個大家族，植物bHLH轉錄因子不僅在植物正常的生長發(fā)育中扮演著重要角色，同時也參與到植物對干旱、鹽及冷脅迫等各種脅迫的應答及激素信號傳導等過程。
　　實驗室前期通過同源克隆方法從花生中克隆到了1個與芝麻SebHLH同源的bHLH類轉錄因子基因，命名為AhbHLH1。酵母單雜交分析表明，其編碼的蛋白可能與花生FAD2基因啟動子存在相互作用。對花生FAD2基因調控區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)，其起始密碼ATG上游

2、200bp的調控區(qū)存在4個E-BOX元件，-90bp～-78bp存在連續(xù)2個，-155bp處1個，-42bp處1個。本研究中，利用帶有His標簽的原核表達系統(tǒng)表達了AhbHLH1蛋白，并通過His-Trap親和層析柱對蛋白進行了分離純化。合成了3個生物素標記的包括不同位置E-BOX的雙鏈DNA探針，并通過電泳遷移率檢測(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)分析了轉錄因子AhbHLH1與上

3、述3個探針的結合能力;同時構建了用于瞬時表達研究AhbHLH1與FAD2基因體內相互作用的效應載體與報告載體。為進一步研究花生AhbHLH1的功能，構建了AhbHLH1的RNAi載體，并與AhbHLH1過表達載體（實驗室前期構建）一起分別對花生進行了遺傳轉化。
　　通過上述研究，取得了以下三方面主要結果:
　　1.EMSA分析AhbHLH1與AhFAD2基因調控區(qū)的結合。將AhbHLH1的5'端加上6個連續(xù)的His構建到原核

4、表達載體pLM1中，在大腸桿菌中誘導表達帶有His標簽的AhbHLH1融合蛋白，并通過His-Trap親和層析柱分離純化了目標蛋白。將-90bp～-78bp連續(xù)2個E-BOX及其側翼序列28bp設計為探針P1;-155bp處的E-BOX及其側翼序列19bp設計為探針P2;-42bp的E-BOX及其側翼序列19bp設計為探針P3，分別探究AhbHLH1與這三組探針的結合情況。AhbHLH1與探針P1特異結合，與探針P2、P3不結合。初步證

5、明，AhbHLH1通過與AhFAD2基因啟動子區(qū)域中-90bp～-78bp連續(xù)兩個E-BOX特異性結合調控其在種子中的表達。
　　2.構建了用于原生質體瞬時表達分析AhbHLH1與AhFAD2調控區(qū)體內相互作用的效應載體與報告載體。出發(fā)載體pBI121帶有CaMV35S全長啟動子驅動的GUS表達框架，克隆100bp最小35S啟動子，替代CaMV35S全長啟動子，構建基本報告載體R0?？寺×伺cE-BOX元件對應的三段調控區(qū)序列I1(

6、-167bp～24bp)、I2(-148bp～35bp)、I3(-167bp～55bp)，并利用In-Fusion方法分別插入到R0載體最小35S啟動子之前，構建了報告載體R1、R2、R3。為后續(xù)通過原生質體瞬時表達分析AhbHLH1與目的啟動子相互作用做準備。
　　3.AhbHLH1基因過表達與RNAi載體的構建及花生的遺傳轉化。利用SiRNA在線分析工具，對AhbHLH1基因的ORF區(qū)進行SiRNA位點的分析，確定目的干擾片段

7、。構建了AhbHLH1基因的RNAi載體與過表達載體（實驗室前期構建）一同進行了花生的遺傳轉化。經(jīng)卡那霉素篩選與PCR驗證，獲得T0代過表達陽性植株3株，T0代RNAi植株3株。
　　下一步，將通過瞬時表達分析，明確AhbHLH1與目的調控區(qū)相互作用;通過分析過表達和RNAi抑制AhbHLH1基因轉基因花生中AhFAD2基因的表達狀況，以及轉基因花生種子儲藏脂的脂肪組成，進一步明確AhbHLH1調控AhFAD2基因在儲藏脂中不飽和