檸條錦雞兒響應(yīng)干旱的miRNA表達(dá)譜分析及Cko-miR2119與靶基因克隆鑒定.pdf

1、干旱導(dǎo)致我國(guó)荒漠化和沙化土地總面積占國(guó)土面積的近45％。檸條作為防風(fēng)固沙的優(yōu)勢(shì)物種，近年來(lái)從生態(tài)價(jià)值、生理特征及形態(tài)解剖等方面進(jìn)行的抗旱機(jī)制研究較多，而在分子水平的機(jī)制闡釋較少，從miRNA調(diào)控入手對(duì)干旱響應(yīng)的解釋更少。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)自然降水梯度下的三個(gè)檸條分布區(qū)的檸條葉樣進(jìn)行miRNA測(cè)序，預(yù)測(cè)與檸條抗旱相關(guān)的miRNAs，結(jié)合miRNA調(diào)控的靶基因?qū)帡l的干旱適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究。同時(shí)為排除其他非生物脅迫的干擾，筆者設(shè)計(jì)室內(nèi)

2、單因素控水實(shí)驗(yàn)，將檸條分別置于土壤相對(duì)含水量為75％，55％和35％三個(gè)不同的水分梯度下模擬野外干旱脅迫。通過(guò)檢測(cè)野外樣品和室內(nèi)控水實(shí)驗(yàn)樣品中與干旱響應(yīng)有關(guān)的miRNA和靶基因的表達(dá)，為闡明檸條抗旱的分子機(jī)制擴(kuò)充有關(guān)miRNAs調(diào)控靶基因響應(yīng)干旱機(jī)理的內(nèi)容。
　　論文主要結(jié)果如下:
　　(1)野外選取黃土高原降水依次減少的三個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（黃陵、榆林和達(dá)拉特旗）檸條葉片進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。三個(gè)樣品分別獲得了13，710，68

3、1，15，048，945和15，198，442條reads。共鑒定獲得490個(gè)已報(bào)道的miRNAs，預(yù)測(cè)96個(gè)未報(bào)道的新miRNAs。
　　(2)對(duì)已鑒定和預(yù)測(cè)的586個(gè)miRNA進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路顯著性富集分析，獲得39個(gè)可能與水分脅迫應(yīng)答相關(guān)的miRNA。利用stem loop qPCR分析驗(yàn)證了miRNA高通量測(cè)序預(yù)測(cè)的9個(gè)差異表達(dá)miRNAs(miR390，miR394，miR398，miR529，miR5

4、30，miR2119，miR5232，miR5559，miR5770)，結(jié)果表明9個(gè)miRNAs的差異表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)一致。
　　(3)對(duì)響應(yīng)干旱較為關(guān)鍵的5個(gè)miRNA(miR390，miR398，miR530，miR2119，miR5559)，室內(nèi)設(shè)計(jì)三個(gè)水分梯度(75％，55％，35％)模擬野外干旱脅迫進(jìn)行驗(yàn)證。利用qPCR同時(shí)對(duì)野外和室內(nèi)檸條樣品miRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明這5個(gè)miRNA對(duì)自然干旱和室內(nèi)干旱

5、梯度具有相同的響應(yīng)趨勢(shì)，即隨干旱加劇檸條miRNA表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢(shì)。
　　(4)進(jìn)而對(duì)其中2個(gè)鮮有報(bào)道的miRNA（miR2119和miR5559）預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行定量分析，野外和室內(nèi)結(jié)果表明隨水分脅迫的加劇這2個(gè)miRNAs的表達(dá)量降低，而各自2個(gè)靶基因卻呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明:miR2119與靶基因BI-1和CAP的表達(dá)趨勢(shì)相關(guān)性R2達(dá)到了0.942和0.852;miR5559與靶基因HIRA和SEO的表達(dá)趨勢(shì)相關(guān)性R

6、2分別達(dá)到了0.960和0.966。
　　(5)進(jìn)一步克隆miR2119和靶基因BI-1和CAP。構(gòu)建pCMBIA-1304-amiR2119、pCMBIA-1304-BI-1和pCMBIA-1304-CAP載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法證實(shí)miR2119與靶基因BI-1和CAP存在互作。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得轉(zhuǎn)miR2119、BI-1和CAP基因的煙草轉(zhuǎn)基因系。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論:證實(shí)高