茶樹microRNAs及其靶基因的鑒定研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類～21nt的小分子非編碼RNA，它由莖環(huán)前體(pre-miRNA)剪切而來(lái)，通過(guò)完全匹配或近似完全匹配靶mRNA，并導(dǎo)致mRNA降解或抑制翻譯的方式行使功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫中起著重要作用。自第一個(gè)植物miRNA在2002年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，數(shù)以千計(jì)的miRNAs在不同物種、不同組織中被發(fā)現(xiàn)。目前，收錄miRNAs的權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)——miRBase已有67種植物共計(jì)5940條miRNAs。在此期間，研

2、究方法從小RNA克隆法發(fā)展到生物信息學(xué)法再到高通量測(cè)序，方法和技術(shù)的革新極大地促進(jìn)了miRNAs的研究。但到目前為止，茶樹miRNAs還未見有系統(tǒng)研究報(bào)道。
　　本研究論文圍繞茶樹miRNAs這一研究方向，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法及高通量測(cè)序技術(shù)，就茶樹miRNAs的鑒定、序列特征及其生物學(xué)功能等進(jìn)行了系統(tǒng)深入的探索性研究。主要研究結(jié)果可以概括為以下幾點(diǎn):
　　1.采用EST分析法對(duì)茶樹EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行研究，從47452條茶樹

3、EST中鑒定出14個(gè)茶樹miRNAs。將鑒定得到的茶樹miRNAs序列，進(jìn)一步與NCBI中的茶樹mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索，鑒定出51個(gè)潛在的靶基因。Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG)注釋表明，這些靶基因可作為轉(zhuǎn)錄因子，或參與應(yīng)激反應(yīng)、跨膜運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控茶樹的生命進(jìn)程。
　　2.利用高通量測(cè)序法對(duì)龍井43一年生扦插苗進(jìn)行茶樹m

4、iRNAs鑒定的研究，從葉片中構(gòu)建的2個(gè)小RNA庫(kù)中（對(duì)照和低溫處理），分別獲得8，599，962和4，961，000條序列比對(duì)上已有的茶樹數(shù)據(jù)庫(kù)。將上述可比對(duì)序列與miRBase v19數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，然后進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)逐一篩選，最終獲得71個(gè)保守miRNAs和223個(gè)特異miRNAs。所鑒定的71個(gè)茶樹保守miRNAs分屬18個(gè)家族。
　　3.通過(guò)差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，miR396和9個(gè)茶樹特異miRNAs表現(xiàn)出

5、顯著上調(diào)或下調(diào)。該結(jié)果表明，這些miRNAs可能在茶樹應(yīng)對(duì)低溫脅迫過(guò)程中起作用。
　　4.利用降解組測(cè)序?qū)ι鲜霾铇鋗iRNAs的靶基因進(jìn)行鑒定，共獲得9，722，127條讀長(zhǎng)(raw reads)。利用CleaveLand3.0分析并繪制t-plots(target plots),對(duì)茶樹miRNAs的靶基因進(jìn)行了大規(guī)模的篩選，鑒定出68個(gè)保守miRNAs的靶基因和39個(gè)特異miRNAs的靶基因。功能注釋和GO分析發(fā)現(xiàn)，這些茶樹mi

6、RNAs不僅參與組織器官發(fā)育，而且參與脅迫應(yīng)答、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分別利用生物信息學(xué)法和高通量測(cè)序法對(duì)茶樹miRNAs及其靶基因進(jìn)行了研究，首次利用測(cè)序方法鑒定了茶樹miRNAs，并通過(guò)對(duì)其靶基因的功能分析，給出了miRNAs在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育和低溫等逆境脅迫中起調(diào)控作用的結(jié)論。希望能夠拓展目前人們對(duì)茶樹miRNAs序列及功能的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)利用miRNAs對(duì)茶樹進(jìn)行遺傳改良，從而為進(jìn)一步培育優(yōu)質(zhì)高效、抗逆的茶樹新品種