疫霉菌效應因子的植物靶標鑒定與功能研究.pdf

1、疫霉菌(Phytophthora capsici)隸屬于卵菌，可以引起多種作物的疫病，對經(jīng)濟造成巨大的損失，包括大豆疫霉、辣椒疫霉、致病疫霉、橡樹疫霉等。疫霉菌在進化上與真菌相差甚遠，和藻類同屬于茸鞭生物界，盡管和其他真菌一樣呈絲狀生長，但是其致病機理與其他真菌差異顯著。基因組測序發(fā)現(xiàn)疫霉菌具有編碼大量效應分子的基因，其中胞內(nèi)效應因子包含RxLR和CRN(Crinkler)兩大類。RxLR效應蛋白在結構上可分為:信號肽、氨基端RxLR-

2、dEER轉(zhuǎn)運結構域和羧基端功能結構域三部分。研究表明RxLR-dEER類蛋白能夠進入植物細胞內(nèi)，且具有毒性功能。CRN效應分子表達量較高，其高度分化的C末端結構域表明了它們可能具有廣泛多樣的功能;而N末端包含有一個LxLFLAK保守基序，與RxLR具有類似的功能，能夠介導CRN效應分子轉(zhuǎn)運進入植物細胞。盡管目前已經(jīng)有研究表明效應因子在含有對應抗病蛋白的植物上能夠引起植物抗性產(chǎn)生，但是對這些效應蛋白和在感病植株上的作用及其機制還不清楚。<

3、br>　　酵母文庫的篩選:采用酵母雙雜交技術，以辣椒疫霉的效應因子RxLR22、CRN4、RxLR242、RxLR207和大豆疫霉的效應因子Avr1b為誘餌蛋白，在擬南芥的cDNA文庫中進行寄主靶標的篩選，并對所有的陽性克隆進行提質(zhì)粒和測序，在NCBI中比對出靶標基因的全長序列與功能信息，分別篩選92個、136個、69個、99個、90個克隆，比對后分別得到78、73、108、62、12個基因，為后續(xù)實驗提供數(shù)據(jù)基礎。
　　辣椒疫霉

4、效應因子與擬南芥抗病相關蛋白互作篩選與驗證:本研究克隆了72個辣椒疫霉在侵染階段中表達量較高的效應分子，其中包括CRN家族的34個，RxLR家族的38個，構建到pGBKT7酵母表達載體上，利用酵母雙雜交技術，對11個擬南芥抗病信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要基因（CMPG1、EDS1、BAK1、BIK1、OSD1、RIN4、PAD4、SGT1a、SGT1b、NPR1和NPR3）進行了定向篩選。實驗結果表明:RxLR103能與EDS1、BAK1、BI

5、K1、NPR3互作，RxLR172能與EDS1、SGT1b互作，RxLR48能與NPR1互作，而RxLR237能自激活，并對所獲結果進行了進一步驗證。
　　轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備:為了研究辣椒疫霉效應因子RxLR103、RxLR172、RxLR237在遺傳學及生理生化上的功能，本文將目的基因構建到植物表達載體pART27中，轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，通過花序浸泡法進行擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，利用卡納抗性篩選出轉(zhuǎn)基因苗，后期發(fā)現(xiàn)Rx

6、LR103轉(zhuǎn)基因擬南芥植物表現(xiàn)為矮小現(xiàn)象，而且有一部分枯萎死亡，而RxLR172和RxLR237的轉(zhuǎn)基因植株生長正常。這為以后的實驗提供了材料基礎。
　　RxLR103初步的功能研究:RxLR103是辣椒疫霉的一個效應分子，利用PVX載體和煙草瞬時表達系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)RxLR103能夠引起煙草葉片上的細胞死亡，同時亞細胞定位顯示，RxLR103在細胞質(zhì)和細胞核上都有定位。RT-PCR分析表明該基因在辣椒疫霉的侵染后期上調(diào)表達，而毒性分析