棉鈴蟲變態(tài)時期差異表達基因的鑒定及真核起始因子5C基因克隆及性質(zhì)研究.pdf

1、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)屬于鱗翅目夜蛾科(Lepidoptera Noctuidae)，在世界各地廣泛分布，危害棉花、谷物、玉米、土豆、大豆、高粱和煙葉等農(nóng)作物達上百種，往往造成巨大的經(jīng)濟損失，是我國和世界農(nóng)業(yè)的主要害蟲之一。目前棉鈴蟲防治中使用的大多數(shù)化學農(nóng)藥對環(huán)境和人類健康有害，而對于轉(zhuǎn)基因作物如Bt抗蟲棉的安全性也存在爭議。因此在理論研究的基礎(chǔ)上，發(fā)展新型生物農(nóng)藥一直是害蟲防治的研究熱點。完全變態(tài)類昆蟲要

2、經(jīng)過周期性幼蟲蛻皮和變態(tài)才能完成整個生活史，昆蟲發(fā)育的生理活動是在一系列激素的精細調(diào)控下才得以順利完成。通過對棉鈴蟲蛻皮相關(guān)基因的研究，不僅可以為進一步了解昆蟲的生長發(fā)育和蛻皮激素調(diào)控的分子機理奠定基礎(chǔ)，而且在此基礎(chǔ)上可以發(fā)現(xiàn)新的分子靶標，為害蟲防治提供新思路。本論文利用抑制性消減雜交(Suppression subtractivehybridization，SSH)的方法鑒定在棉鈴蟲變態(tài)時期差異表達的新基因，并從中選擇棉鈴蟲真核起始因

3、子5C(eukaryotic translation initiation factor 5C，eIF5C)作為研究對象，克隆了該基因的全長，并對它的性質(zhì)進行了研究。 蛻皮對于全變態(tài)昆蟲來說，是一個重要的生理過程。全變態(tài)昆蟲的一生經(jīng)由一系列蛻皮活動完成，其中包括幼蟲蛻皮，即各個齡期之間的蛻皮、化蛹蛻皮和羽化蛻皮，后兩者稱為變態(tài)蛻皮。幼蟲蛻皮包括不吃少動的昏睡階段和脫皮階段兩個生理過程，而變態(tài)過程更為復雜，除與幼蟲蛻皮相似的蛻皮級

4、聯(lián)反應外，還包括幼蟲組織解體和成蟲組織重建。蛻皮受蛻皮激素20-OH-蛻皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)共同調(diào)控。當保幼激素存在時，蛻皮激素啟動幼蟲不同齡期間的蛻皮，當保幼激素滴度降低或消失時，蛻皮激素啟動變態(tài)蛻皮。越來越多的證據(jù)證明有很多的激素和調(diào)節(jié)因子參與這個復雜的蛻皮信號途徑。目前已經(jīng)證明一些轉(zhuǎn)錄因子如EcR，USP，HR3，Broad C和細胞程序性死亡基因

5、參與該途徑，也鑒定了一些調(diào)控基因如Broad complex，E74B和E93，但對它們的下游基因還知之甚少，因此，蛻皮的分子機理仍然知之甚少。棉鈴蟲屬鱗翅目，與煙草天蛾(Manduca sexta)和家蠶(Bombyx mori)有共同的蛻皮特征，由于沒有基因組測序和商業(yè)芯片，蛻皮和變態(tài)差異表達基因的鑒定尤為困難。本室前期工作中已經(jīng)用雙向電泳的方法新鑒定了30個蛋白在蛻皮時期高表達，在此基礎(chǔ)上擬用抑制性消減雜交的方法鑒定更多蛻皮變態(tài)相

6、關(guān)的新基因。本文進行了變態(tài)時期各個組織與取食時期各個組織的抑制性消減雜交鑒定變態(tài)時期差異表達的基因，并用取食時期各個組織與變態(tài)時期進行抑制性消減雜交鑒定取食時期差異表達的基因。與本實驗室柴連琴等完成的幼蟲蛻皮時期抑制性消減雜交SSH文庫共同分析，共得到100個表達序列標簽expressed sequence tags(ESTs)，其中73個在基因庫中有相似序列，27個為未知基因。進一步用RT-PCR的方法驗證SSH的結(jié)果。有11個基因已

7、經(jīng)證明在蛻皮或變態(tài)時期表達水平有所變化，可能參與蛻皮變態(tài)過程。該研究提供了一系列鱗翅目昆蟲蛻皮或變態(tài)差異表達的新基因，如真核起始因子5(eIF5C)，核轉(zhuǎn)移因子等，它們可以作為進一步研究鱗翅目昆蟲幼蟲蛻皮和變態(tài)調(diào)控機理的候選基因。該研究將拓展我們在全變態(tài)昆蟲幼蟲蛻皮和變態(tài)級聯(lián)反應過程中的知識。 本論文選擇其中的eIF5C進行了表達模式等性質(zhì)研究。真核翻譯起始階段需要很多蛋白質(zhì)因子的參與，大量證據(jù)證明，真核翻譯起始因子(eukar

8、yotic translation initiation factors，eIFs)不僅在蛋白質(zhì)翻譯的起始過程中有重要作用，還參與很多其它的生命活動。一些eIFs已經(jīng)證明與信號途徑有關(guān)，如果蠅eIF4A通過介導SMAD(mother against dpp)降解負調(diào)控Dpp/BMP(decapentaplagic/bone morphogenetic protein)信號途徑，eIF6選擇性調(diào)控Wnt信號途徑。eIF5C蛋白包含一個N端

9、的亮氨酸拉鏈基序和一個C端的eIF5C結(jié)構(gòu)域。目前對eIF5C功能的研究很少，僅在果蠅中報道它與核糖體蛋白L5相互作用，可能參與蛋白合成。但含有eIF5C功能域或者亮氨酸拉鏈基序的其它同源基因功能報道較多，如果蠅中cryptocephal基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白調(diào)控蛻皮和變態(tài)，具有GTP酶活化蛋白的功能，與細胞周期調(diào)控有關(guān)等。由于同源基因具有相似的功能，我們推測在變態(tài)時期高表達的eIF5C可能在蛻皮變態(tài)過程中行使重要功能。 以SS

10、H文庫中獲得的EST為基礎(chǔ)，我們從棉鈴蟲中克隆到了eIF5C的全長基因。cDNA全長1675 bp，開放閱讀框1260 bp，編碼419個氨基酸(GenBank接收號EU526835)，命名為Ha-eIF5C在大腸桿菌中重組表達，并用Glutathione Sepharose 4B(GS4B)柱純化，用以免疫家兔制備多克隆抗體。 實時定量PCR (Quantitative real-time PCR，QRT-PCR)分析Ha-e

11、IF5C mRNA轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示Ha-eIF5C在變態(tài)時期的頭胸部、表皮、中腸和脂肪體組織中都有高表達。QRT-PCR分析Ha-eIF5C在中腸和脂肪體各發(fā)育階段的表達發(fā)現(xiàn)，Ha-eIF5C在5齡頭殼爆裂時期有一個短暫的表達小高峰，然后在變態(tài)時期顯著上調(diào)。免疫印記結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)水平上，Ha-eIF5C在中腸和脂肪體各發(fā)育階段的表達情況和mRNA表達水平一致。免疫組織化學結(jié)果顯示，在中腸中，Ha-eIF5C定位于胞質(zhì)，較強的信號分布在