核呼吸因子-1基因的克隆,真核表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的：克隆NRF-1基因，并對(duì)NRF-1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，了解其基本結(jié)構(gòu)和蛋白分子特征，及NRF-1與相關(guān)蛋白分子的作用關(guān)系，為后續(xù)研究NRF-1的功能及在心力衰竭的心肌細(xì)胞中作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)支持和研究思路。構(gòu)建NRF-1重組慢病毒，并感染大鼠心肌細(xì)胞（H9c2（2-1）細(xì)胞），然后篩選出穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)NRF-1的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細(xì)胞，為今后研究NRF-1基因?qū)λソ咝募〖?xì)胞的調(diào)節(jié)作用及后續(xù)的基因治療打下基礎(chǔ)。
　　方

2、法：1.NRF-1的生物信息學(xué)分析：通過(guò)在線(xiàn)軟件EXPASY，PSSFinder，PSITE，SignalP，Swiss-model，STRING對(duì)NRF-1的氨基酸構(gòu)成，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)，信號(hào)肽，三維結(jié)構(gòu)，以及與相關(guān)蛋白之間的作用關(guān)系進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。
　　2.NRF-1基因的克隆與鑒定：2.1NRF-1基因的克?。和ㄟ^(guò)生物合成與重疊延伸PCR技術(shù)克隆NRF-1基因，并重組于載體pMD18-T，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌

3、（E.coil DH5?）；2.2 NRF-1基因的鑒定：PCR及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒 NRF-1/pMD18-T序列正確性。
　　3.構(gòu)建NRF-1重組慢病毒與穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)NRF-1的H9c2(2-1)細(xì)胞：3.1 NRF-1重組慢病毒的包裝與滴度測(cè)定：將NRF-1基因重組至pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP載體，利用lipofectamine2000將重組載體pLenti6.3-NRF-1-IRES2-EGFP與兩種

4、包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，包裝成重組慢病毒，并測(cè)定病毒滴度；3.2 NRF-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細(xì)胞的最適轉(zhuǎn)染濃度測(cè)定：用陰性病毒液按梯度感染H9c2（2-1）細(xì)胞，選出合適的MOI值；3.3陽(yáng)性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細(xì)胞的最適抗生素濃度測(cè)定：將重組慢病毒按選出的MOI值感染H9c2(2-1)細(xì)胞，然后用Blasticidin按濃度梯度篩選轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，選出合適的篩選濃度；3.4陽(yáng)性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細(xì)胞的鑒定：用抗生

5、素按照最適篩選濃度持續(xù)篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的H9c2（2-1）細(xì)胞，獲得穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)NRF-1的轉(zhuǎn)染陽(yáng)性靶細(xì)胞，經(jīng)PCR，QPCR和Western blot鑒定轉(zhuǎn)染陽(yáng)性靶細(xì)胞的NRF-1表達(dá)量。
　　結(jié)果：1.生物信息學(xué)分析表明NRF-1的蛋白質(zhì)分子量為57280.1 Da，等電點(diǎn)為5.28，分子式為C2498H3976N704O808S15，有534個(gè)氨基酸，其中46個(gè)堿性氨基酸，64個(gè)酸性氨基酸，148個(gè)極性氨基酸，191個(gè)疏水性氨基

6、酸。有46(Arg+Lys)個(gè)帶正電荷的殘基，有64(Asp+Glu)個(gè)帶負(fù)電荷的殘基，不穩(wěn)定系數(shù)為35.74，總的平均親水系數(shù)為–0.334，說(shuō)明NRF-1是穩(wěn)定的親水蛋白；NRF-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊較多，且分布均勻；NRF-1有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，5個(gè)蛋白激酶 C磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)酪蛋白激酶 II磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)端?；稽c(diǎn)，1個(gè)酰胺化位點(diǎn)，11個(gè)微體羧基端定位信號(hào)；STRING蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示N RF-1與10個(gè)因子

7、具有不同程度相關(guān)性。
　　2.重組質(zhì)粒NRF-1/pMD18-T經(jīng)測(cè)序鑒定，NRF-1基因序列與原始序列一致。
　　3.構(gòu)建出NRF-1重組慢病毒，病毒滴度是5.5×107 TU/ml；重組慢病毒轉(zhuǎn)染H9c2(2-1)細(xì)胞的合適 MOI值為100；陽(yáng)性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細(xì)胞的最適抗生素篩選濃度為3μg/ml；NRF-1重組慢病毒按MOI=100轉(zhuǎn)染H9c2(2-1)細(xì)胞，經(jīng)3μg/ml抗生素持續(xù)篩選后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H9

8、c2(2-1)細(xì)胞，PCR鑒定結(jié)果顯示慢病毒攜帶NRF-1插入靶細(xì)胞基因組，QPCR結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的NRF-1的mRNA表達(dá)量比對(duì)照組細(xì)胞高2.25倍，Western blot結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的NRF-1蛋白表達(dá)量比對(duì)照組細(xì)胞高1.28倍。
　　結(jié)論：1.生物信息學(xué)分析NRF-1的氨基酸構(gòu)成及蛋白分子特征，了解到NRF-1與相關(guān)蛋白分子的作用關(guān)系，以及這些因子的功能特點(diǎn)。
　　2.成功克隆出NRF-1基因，并獲