棉花抗黃萎病生防菌的篩選和鑒定及抗病機(jī)理研究.pdf

1、棉花是重要的纖維植物，在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一種維管束病害，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量與品質(zhì)。由于沒有有效的防治藥物，黃萎病的防治很困難。且陸地棉中缺少抗病種質(zhì)資源，抗病育種進(jìn)展緩慢。生物防治被認(rèn)為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ㄖ?，在植物病害防治中具有非常好的?yīng)用前景，但棉花的生物防治尚沒有明顯進(jìn)展。繼續(xù)篩選抗黃萎病的生防菌，揭示其抗病機(jī)理，并篩選

2、抗菌物質(zhì)，以及進(jìn)行抗黃萎病菌基因的克隆對于棉花黃萎病的防治、抗病育種等研究具有重要意義。
　　本研究以棉花黃萎病菌V1070菌系為靶標(biāo)菌，以具有不同黃萎病抗性的棉花品種為材料，選擇性分離棉花植株內(nèi)不同功能群體的內(nèi)生細(xì)菌，研究品種抗病性與內(nèi)生菌群體組成的關(guān)系。結(jié)果表明棉花品種的抗病性與內(nèi)生菌群體的結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。根據(jù)品種hi菌落的形態(tài)分離得到660株棉花內(nèi)生菌，通過平板實(shí)驗(yàn)篩選，150株內(nèi)生菌具有拮抗V1070的活性，被確定為拮抗菌

3、。高比例的拮抗菌存在于抗黃萎病品種的根系中，抗病品種根系中的拮抗菌的比例顯著高于感病品種，棉花品種對黃萎病的抗性可能與內(nèi)生菌的種類和數(shù)量有關(guān)。通過ARDRA分析，150個(gè)株菌被分為19個(gè)組，存在顯著的遺傳多樣性。16SrRNA基因測序分析表明，拮抗菌中數(shù)量最多的是Pseudomonas(43.3％)，其次是Bacillus(34.7％)和Enterobacter(10％)。有些拮抗菌不僅含有拮抗物質(zhì)，還能分泌促進(jìn)植株生長的物質(zhì)，存在代謝

4、多樣性。以上結(jié)果表明，棉花植株的抗病性與內(nèi)生菌的群體結(jié)構(gòu)和抗黃萎病菌活性有關(guān)，抗病品種可作為篩選抗黃萎病生防菌的材料。
　　通過溫室和田間試驗(yàn)，45株拮抗菌中有12株菌株對黃萎病具有良好的生防效果，都能降低棉花植株黃萎病的病指。有5株拮抗菌在田間的防效高于20％，能顯著減少棉花的萎焉癥狀。這些菌株表現(xiàn)較好的生防效應(yīng)，還能不同程度的提高植株的產(chǎn)量。綜合分析盆栽和田間防治棉花黃萎病試驗(yàn)結(jié)果，菌株841P-3和41B-1菌株在田間都能極

5、顯著地降低棉花黃萎病的病情指數(shù)，而且防治效果較高，分別為22.79％和28.09％，因此是較好的防治棉花黃萎病的生防菌，有作為生物農(nóng)藥利用的潛力。另外我們發(fā)現(xiàn)Bacillus spp.拮抗菌的生防效應(yīng)好于Pseudomonas spp.。以上結(jié)果表明在體外具有抑菌活性的菌株在田間也能不同程度地提高棉花抗黃萎病能力和產(chǎn)量。
　　在平板檢測實(shí)驗(yàn)中，假單胞菌841P-3表現(xiàn)很強(qiáng)的抑菌活性，能使棉花黃萎病萎菌菌絲扭曲變形、膨大。電鏡觀察發(fā)

6、現(xiàn)菌株841P-3能在棉花根部形成膜狀結(jié)構(gòu)，且大量定殖于棉花根系的表面和內(nèi)部，可能通過競爭或在根系表面形成生物膜抵抗病原菌的侵染。根部接種和體外葉片接種實(shí)驗(yàn)表明，菌株841P-3能夠減少根部和葉片病菌的生長、定殖和侵染。菌株841P-3還能夠誘導(dǎo)棉花植株根系的木質(zhì)素化，能誘導(dǎo)葉片胼胝質(zhì)沉積、活性氧的爆發(fā)和誘導(dǎo)多種抗病相關(guān)物質(zhì)的增加。菌株841P-3對棉花植株產(chǎn)生的防御反應(yīng)能持續(xù)至少30天，通過二次接種，這些防御反應(yīng)能被再次誘導(dǎo)。菌株84

7、1P-3能直接誘導(dǎo)棉花的防御反應(yīng)，在感受到來源于病原菌的信號后，能啟動更強(qiáng)的防御反應(yīng)來應(yīng)對病原的襲擊。進(jìn)一步研究了841P-3誘導(dǎo)抗性的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)841P-3能誘導(dǎo)MAPK轉(zhuǎn)錄因子WRKY和棉花防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。以棉花表皮細(xì)胞為研究材料，發(fā)現(xiàn)NO參與841P-3誘導(dǎo)棉花抗病性的提高，為棉花黃萎病的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　在平板檢測實(shí)驗(yàn)中，解淀粉芽孢桿菌41B-1表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性，能使棉花黃萎病菌V1070的菌絲扭曲變形、

8、膨大。菌株41B-1的發(fā)酵代謝液和甲醇提取物均能抑制V1070的生長。通過色譜質(zhì)譜分析，抗真菌物質(zhì)為脂肽類伊枯草菌素及其同系物。體外平板檢測，菌株41B-1產(chǎn)生的伊枯草菌素能抑制V1070微菌核的生長，也能抑制V1070微菌核在土壤中的萌發(fā)，阻止其侵染棉花植株的根系，最終降低植株的萎焉癥狀。伊枯草菌素處理能誘導(dǎo)V1070細(xì)胞活性氧爆發(fā)，細(xì)胞腫脹（高滲透甘油反應(yīng)）和細(xì)胞壁完整性缺失，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡和裂解。細(xì)胞死亡和裂解會產(chǎn)生PAMP而激

9、發(fā)寄主的免疫反應(yīng)。細(xì)胞壁組分在V1070抵抗伊枯草菌素中起重要作用?？┚鎸σ量莶菥卣T導(dǎo)的黃萎病菌的敏感性具有促進(jìn)作用，而百草枯對伊枯草菌素誘導(dǎo)的黃萎病菌的敏感性具有抑制作用。而且，除了直接的抑菌作用，伊枯草菌素處理棉花還能誘導(dǎo)植株防御反應(yīng)和增加PAMP激發(fā)的免疫反應(yīng)，同時(shí)減少棉花根部病菌孢子的定殖?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們推斷伊枯草菌素通過介導(dǎo)多種抗病途徑提高棉花植株對V1070的抗病性。
　　本研究篩選出大量的抗黃萎病菌的棉花內(nèi)生