基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的超富集植物鼠耳芥抗Zn-Cd脅迫基因篩選及初步分析.pdf

1、超富集植物是自然界中一類能夠超量吸收重金屬并將其轉(zhuǎn)移至地上部的植物，因其對(duì)重金屬出色的耐受和累積能力，成為研究重金屬累積耐受遺傳調(diào)控機(jī)制和土壤植物修復(fù)的重要材料。對(duì)超富集植物重金屬應(yīng)答和適應(yīng)性調(diào)控基因的鑒定和分析，為植物重金屬環(huán)境適應(yīng)能力的遺傳改良提供候選基因資源和理論依據(jù)，進(jìn)而為通過植被種植治理土壤重金屬污染奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以Zn/Cd超富集植物鼠耳芥作為研究對(duì)象，以非超富集模式植物擬南芥作為參照，分別用Zn和Cd對(duì)鼠耳芥

2、和擬南芥處理2小時(shí)和8小時(shí)后，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)手段對(duì)這兩個(gè)近緣物種進(jìn)行物種內(nèi)以及物種間的重金屬應(yīng)答和適應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行篩選和鑒定。主要結(jié)果如下：
　　在驗(yàn)證鼠耳芥對(duì)Zn/Cd的超富集能力以后，分別提取擬南芥鼠耳芥總RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在種內(nèi)差異分析中發(fā)現(xiàn)擬南芥和鼠耳芥在 Zn脅迫下響應(yīng)的差異顯著基因要比Cd脅迫下響應(yīng)的差異顯著基因要多，并且隨著時(shí)間從2小時(shí)變?yōu)?小時(shí)，兩個(gè)物種中的差異顯著基因數(shù)量變少，推測(cè)這可能與物種對(duì)外

3、界脅迫的適應(yīng)性有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)擬南芥中差異顯著基因要比鼠耳芥芥多，推測(cè)鼠耳芥中抗Zn/Cd脅迫基因?qū)n/Cd的解毒能力要比擬南芥中的強(qiáng)。
　　通過GO富集發(fā)現(xiàn)鼠耳芥、擬南芥差異顯著基因顯著富集的GO詞條類似，在和重金屬解毒有關(guān)的催化活性、結(jié)合相關(guān)以及轉(zhuǎn)運(yùn)活性等GO詞條上都有顯著富集。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)鼠耳芥擬南芥在Zn/Cd脅迫下的差異顯著基因在和重金屬解毒有關(guān)的硫代謝途徑和谷胱甘肽代謝途徑都顯著富集。在分析了谷胱甘肽代謝途徑

4、上多數(shù)富集的GSTs以后發(fā)現(xiàn)，只分析物種內(nèi)差異表達(dá)基因不夠全面，需要進(jìn)行跨物種分析。
　　構(gòu)建鼠耳芥、擬南芥同源基因集，鼠耳芥中14753個(gè)基因和擬南芥中14907個(gè)基因構(gòu)成15221個(gè)對(duì)應(yīng)關(guān)系。跨物種差異分析發(fā)現(xiàn)同物種內(nèi)部差異分析比較類似對(duì)Zn響應(yīng)的差異顯著基因要比Cd多，且隨著時(shí)間從2小時(shí)到8小時(shí)差異顯著基因數(shù)量減少。將鼠耳芥內(nèi)部在Zn/Cd脅迫下差異顯著表達(dá)的1138個(gè)基因、擬南芥內(nèi)部差異顯著表達(dá)的1253個(gè)基因和物種間差異

5、顯著表達(dá)的6692個(gè)基因進(jìn)行整合找到1102個(gè)既在物種內(nèi)部差異顯著又在物種間差異顯著的基因，結(jié)合功能注釋后找打97個(gè)對(duì)抗Zn/Cd脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因。
　　將得到的97個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行熱圖分析發(fā)現(xiàn)12個(gè)與體內(nèi)金屬離子平衡相關(guān)的在鼠耳芥中大量表達(dá)但在擬南芥中表達(dá)少的基因，這些基因涉及Zn、Cd等二價(jià)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)以及螯合過程，NAS家族基因在擬南芥中主要與抗氧化脅迫以及重金屬螯合相關(guān)。對(duì)鼠耳芥中NAS家族基因進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)在鼠耳芥

6、中NAS家族有5個(gè)成員而擬南芥只有4個(gè)，通過保守基序分析發(fā)現(xiàn)鼠耳芥中NAS基因在3`端保守性較高，通過qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)種內(nèi)和種間間差異分析得到AhNAS2及AhNAS3兩個(gè)差異顯著基因是在Zn/Cd脅迫下響應(yīng)的，推測(cè)在鼠耳芥中這兩個(gè)基因同樣也與Zn/Cd螯合相關(guān)。
　　將這其中出現(xiàn)頻率較高的ZIP家族基因進(jìn)行初步分析，ZIP家族基因是植物中普遍存在，主要與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。在鼠耳芥中找到11個(gè)ZIP家族基因，通過分析他們的一級(jí)

7、、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)他們出AhZIP2和AhZIP3以外，都具有保守的ZIP superfamily保守結(jié)構(gòu)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄所得數(shù)據(jù)以及qPCR驗(yàn)證推測(cè)AhZIP1可能同AtZIP1一樣在根部中表達(dá)量較小且其對(duì)Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)特性要強(qiáng)于Cd。AhZIP7和擬南芥中同源基因AtZIP9一樣在Zn脅迫下表達(dá)下調(diào)而在Cd脅迫下未見明顯響應(yīng)情況，推測(cè)AhZIP7是 Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白但是對(duì)Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)能力還有待研究。AhZIP8與擬南芥中同源基因AtZIP10