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文檔簡介
1、山新楊(Populus davidiana Dode×P.bollena Lauche)以黑龍江野生山楊為母本,新疆楊為父本的人工雜交種。雖然山新楊和其楊樹他品種相比具有一定的抗病性,但也常常遭受病原菌的侵染而引起大面積流行,給林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)造成巨大的損失。針對楊樹病害種類多、流行快、危害重的實際,本文以山新楊為受體材料、以幾丁質(zhì)酶為目的基因,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行了抗真菌病害轉(zhuǎn)山新楊的研究。
1、以1/2MS附加0.
2、03 mg/La-萘乙酸(NAA)和0.05 mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)為葉片分化培養(yǎng)基、1/2MS附加0.05 mg/La-萘乙酸(NAA)和0.05 mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)為莖段分化培養(yǎng)基和1/2MS附加0.25 mg/La-萘乙酸(NAA)為生根培養(yǎng)基對山新楊進(jìn)行組培和擴繁,為遺傳轉(zhuǎn)化提供優(yōu)良的受體材料。
2、通過抗生素的敏感性實驗,分別確定了山新楊葉片轉(zhuǎn)化中卡那霉素最佳臨界濃度為8 mg/L、生根篩
3、選培養(yǎng)的最佳臨界濃度為40 mg/L、頭孢噻肟鈉除菌最佳濃度為800 mg/L。
3、以山新楊葉片為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,菌液的侵染最適濃度為OD600≤0.1、最佳侵染時間為5min。在該組合條件下,共培養(yǎng)基中不添加CoCl2·6H2O比添加CoCl2·6H2O的分化率提高1倍以上,轉(zhuǎn)化率提高近1倍。
4、根據(jù)正交試驗設(shè)計確定了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化率的菌液濃度、侵染時間、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時間四種因素的最
4、佳組合。建立了以1/2MS液體培養(yǎng)基附加50μmol/L乙酰丁香酮于28℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)12~14h;菌液離心收集菌體后用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮稀釋至OD600=0.1,侵染2~5min;共培養(yǎng)培養(yǎng)基中去除CoCl2·6H2O并附加200μmol/L乙酰丁香酮,共培養(yǎng)3d為最佳轉(zhuǎn)化體系。
5、以生長10~15d的山新楊組培苗葉片為受體材料,利用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)組合對324個葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化,共得18株卡那抗性芽,經(jīng)PC
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