棘孢木霉Hsp24基因轉(zhuǎn)化山新楊培育抗病轉(zhuǎn)基因株系.pdf

1、楊樹具有無性繁殖容易、生長速度快和生長周期短的特性，是重要的纖維用材，在全世界被廣泛種植。然而許多生物及非生物因子對楊樹的生長造成了嚴(yán)重的影響，減少了木材產(chǎn)量。而木霉作為優(yōu)良的生防真菌，具有大量的防衛(wèi)響應(yīng)及抗病基因，如熱激蛋白基因，其在木霉的生物防治機(jī)制中起到了十分重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)以棘孢木霉ACCC30536轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆到了熱激蛋白基因Hsp24的DNA序列，由于此基因無內(nèi)含子，cDNA與DNA序列一致，Ge

2、nBank接受號為KP337939，全長為657bp，編碼218個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，熱激蛋白Hsp24的分子量為24.3kDa，等電點(diǎn)是5.50，屬于Hsp20家族。通過實(shí)時(shí)熒光定量方法，研究了棘孢木霉ACCC30536熱激蛋白基因Hsp24在10種條件下的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，在堿、鹽、干旱、高溫和楊樹葉枯病及爛皮病發(fā)酵液脅迫下，熱激蛋白基因的表達(dá)量均上調(diào)，尤其在高溫和楊樹爛皮病脅迫下上調(diào)最高，分別為51.6和31.1倍。

3、r>　　為了構(gòu)建具備良好抗病性的山新楊轉(zhuǎn)化子，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Hsp24基因整合到山新楊基因組上，并成功得到重組株系Pdpap-Hsp24s。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)對照山新楊Pdpap-Con中無Hsp24基因表達(dá)，而山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s中Hsp24基因大量表達(dá)，證實(shí)Hsp24已經(jīng)在轉(zhuǎn)化子中成功的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因楊樹病程相關(guān)蛋白基因PR表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子pROK2-Hsp24s中的大部分PR基因上調(diào)表達(dá)，尤其是轉(zhuǎn)化子P

4、dpap-Hsp24-3中的PR-8被上調(diào)了215.93倍。
　　在楊樹爛皮病的脅迫下，楊樹抗病信號傳遞相關(guān)基因的RT-qPCR發(fā)現(xiàn)Pdpap-Hsp24-3中的NPR1基因被上調(diào)了4.76倍，Pdpap-Hsp24-1中的JAR1和MYC2分別被上調(diào)了2.35和4.08倍。進(jìn)而，NBT及EtBr葉片染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s與對照Pdpap-Con相比葉片的顏色更淺，表明轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s具有更強(qiáng)的抗楊樹

5、爛皮病的能力。POD及SOD酶活性檢測發(fā)現(xiàn)Pdpap-Hsp24s與Pdpap-Con相比，POD及SOD酶活性更高，最高時(shí)分別達(dá)到37.7U和51.17U;用葉枯病侵染葉片后，發(fā)現(xiàn)Pdpap-Hsp24s和Pdpap-Con的葉片發(fā)病率分別為53％和81％，表明山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s具有更強(qiáng)的抗楊樹葉枯病的能力。
　　綜上所述，棘孢木霉ACCC30536熱激蛋白Hsp24基因在山新楊中的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)化子Pdpap-