GsCHX19基因?qū)φ貣|紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及新株系的培育.pdf

1、我國鹽堿地面積約9913萬公頃，近年來還有逐步擴大的趨勢。伴隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料與食用糧需求量大幅上升，而東北地區(qū)存在大面積鹽堿地土壤，也嚴(yán)重限制了糧食及畜牧業(yè)的發(fā)展。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）素有“牧草之王”的美譽，它作為重要的飼料作物的同時，也是改良土壤和保持水土的重要作物。隨著基因工程技術(shù)的利用與發(fā)展的日益成熟，轉(zhuǎn)基因苜蓿的研究同樣也有著良好的發(fā)展勢頭，其中，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿子葉節(jié)的方法，因其具有易操作

2、，轉(zhuǎn)化效率高，外源基因整合拷貝數(shù)少等特點，克服了傳統(tǒng)遺傳育種的缺點，成為培養(yǎng)苜?？鼓嫘孕缕废抵凶钣行У氖侄沃弧Ｅ嘤望}堿轉(zhuǎn)基因苜?？梢猿浞掷梦覈}堿地資源，提高苜蓿產(chǎn)量，對發(fā)展畜牧業(yè)和改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
　　CHX（cation/H+ exchanger）是植物體內(nèi)存在于細(xì)胞質(zhì)膜或液泡膜等細(xì)胞膜上，編碼Na+、K+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白的一類基因家族。CHX基因家族屬于CPA(cation/protonantiporter

3、)超家族。CPA超家族通過Na+、Li+或K+交換H+以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)陽離子和pH穩(wěn)態(tài)。原核生物及真核生物CPA超家族主要包括CPA1和CPA2兩類。植物體中的CPA1與細(xì)菌的NhaP具有很高的序列相似性，包括研究較為廣泛的NHX(Na+/H+ exchanger)家族。相對研究較少的CPA2家族包括KEA（K+-efflux antiporter）和CHX，其中CHX與酵母KHA1及Synechocystis的NhaS4有很高的序列相似性

4、。目前研究表明，CHX蛋白僅存在于高等植物中，約800個氨基酸，包括N末端約400殘基的疏水性Na+/H+交換器以及C末端約300～400的親水性結(jié)構(gòu)域。由于親水C末端不包含已知的保守結(jié)構(gòu)域，因此它的功能是未知的。但是并不是所有的CHX都具有這樣的特性。例如，預(yù)測來自細(xì)菌的NhaS4蛋白編碼715個氨基酸，實際上只編碼410個。
　　本實驗室前期已得到具有自主知識產(chǎn)權(quán)、在非生物脅迫反應(yīng)中起重要作用的GsCHX19基因與pCAMBI

5、A330035S植物表達(dá)載體連接，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過生物信息學(xué)方法及分子生物學(xué)方法確定得到新的耐鹽堿綜合改良苜蓿新品系。本研究為耐鹽堿轉(zhuǎn)基因苜蓿的培育，提供了重要的研究材料。主要研究結(jié)果如下:
　　(1) GsCHX19基因的生物信息學(xué)分析
　　鹽堿脅迫應(yīng)答基因GsCHX19基因是本實驗室在前期研究中獲得，本研究所選用的CHX19基因來源于野生大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，該基因在轉(zhuǎn)錄水平積極響應(yīng)堿脅

6、迫的誘導(dǎo)，推測其可能積極參與了堿脅迫信號傳導(dǎo)途徑，在堿脅迫通路中具有重要的功能。通過生物信息學(xué)方法，對基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、親疏水性、磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能注釋等生物信息學(xué)分析，并預(yù)測其蛋白的結(jié)構(gòu)域，預(yù)測該基因上游啟動子的滲透脅迫相關(guān)調(diào)控元件，為下一步研究提供依據(jù)。
　　(2) GsCHX19基因?qū)ψ匣ㄜ俎５倪z傳轉(zhuǎn)化和抗性植株的獲得
　　以肇東紫花苜蓿為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將已得到具有自主知識產(chǎn)權(quán)、在非生物脅

7、迫反應(yīng)中起重要作用的GsCHX19基因與pCAMBI A330035Su植物表達(dá)載體連接，對苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的受體為苜蓿子葉節(jié)，通過再生體系獲得抗性植株20株。
　　(3)轉(zhuǎn)GsCHX19基因抗性植株的分子生物學(xué)檢測
　　對獲得的20株轉(zhuǎn)GsCHX19基因抗性植株進(jìn)行PCR檢測，獲得PCR陽性植株16株，PCR陽性率為80％;對PCR陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測，獲得11株GsCHX19基因在轉(zhuǎn)錄水平上超量表達(dá)的植株，