銀耳遺傳轉化受體菌株篩選及其發(fā)酵條件研究.pdf

1、銀耳(Tremella fuciformis Berk)又稱白木耳，是一種食藥兼用的真菌，因其特殊的生活史，既可以人工栽培，又可以以酵母狀芽孢進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，因而它是進行遺傳轉化的理想材料。在利用其進行遺傳轉化、轉基因作物栽培和發(fā)酵之前首先要解決的問題就是模式受體菌株的篩選、銀耳芽孢菌株的栽培技術的建立、發(fā)酵技術及其遺傳背景的研究。為此，本文就從3個方面去研究：一是銀耳遺傳轉化受體菌株篩選；二是銀耳遺傳轉化受體菌株的發(fā)酵條件研究；三

2、是受體菌株銀耳交配型因子的初步研究。具體結果如下： 1、銀耳遺傳轉化受體菌株篩選 本實驗從形態(tài)學、分子水平、對潮霉素的敏感程度以及生物量方面對19個測試菌株進行篩選。結果從19個測試菌株中篩選到對潮霉素敏感且生長速度最快的高產(chǎn)菌株T0040。再以T0040為出發(fā)菌株，通過出耳，彈射單擔孢子，獲取其可配對擔孢子，為以后遺傳背景的研究以及用于雙基因轉化的擔孢子的獲得提供可靠材料。為解決利用轉基因的芽孢進行栽培試驗可能面臨的出

3、耳難的問題，進行營養(yǎng)轉化條件的研究，得到兩種可以誘導銀耳芽孢向菌絲萌發(fā)的培養(yǎng)基配方，分別是：配方二10％麩液、10％香灰菌木屑提取液、硫酸銨1.0g、麥芽糖10.0g、葡萄糖10.0g、瓊脂30.0g；配方三細米粉500.0g、麩皮500.0g、骨粉10.0g、過磷酸鈣10.0g、硫酸銨1.0g。 2、響應面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的優(yōu)化是微生物培養(yǎng)中必須進行的一個重要環(huán)節(jié)。利用單因素實驗分析碳源、氮源、礦質(zhì)元素、維生素

4、、生長素五個單因子對芽孢生物量的影響，結果顯示5個因素對芽孢生物量的影響均達到顯著水平。根據(jù)實驗的結果選擇碳源葡萄糖、氮源蛋白胨，礦質(zhì)元素硫酸鎂，維生素VB1為實驗優(yōu)化的因子。利用響應面的方法進行尋優(yōu)，響應面法可以在較少的實驗次數(shù)中得到培養(yǎng)基組分的最佳搭配情況，從而降低實驗成本。本文利用該法成功探索出篩選出的模式菌株T0040的發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖33.91g/L，蛋白胨8.29g/L，硫酸鎂2.81g/L，VB114.43mg/L，KH

5、2PO40.5g/L。 3、銀耳遺傳交配因子的初探 芽孢的配對實驗得到3對可以配對出耳的擔孢子分別是：T1與T26、T1與T19、T4與T13。對銀耳的交配型因子從分子水平進行了初步的探討，利用簡并PCR的方法成功克隆了銀耳的線粒體間隔肽(MIP)基因。同時也嘗試了用簡并PCR去克隆銀耳T0040的B交配型因子的STE3-like pheromone receptor片段，利用生物信息學的方法進行了結構功能預測。這些工作