11家族林木聚糖酶的熱穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)特征的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)決定其功能,二硫鍵,離子對,疏水作用等結(jié)構(gòu)因素都會影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。大量的晶體結(jié)構(gòu)研究表明,嗜溫性和嗜熱性的蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū)域的序列和結(jié)構(gòu)很保守,這表明嗜溫性的蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水核心的氨基酸同樣堆積得非常有效,以保證其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及功能的行使。在蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū)域的點(diǎn)突變常常會破壞這種堆積效果,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定的降低。因此目前對于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性提高的點(diǎn)突變大多數(shù)都是發(fā)生在蛋白質(zhì)的表面。
　　 本論文第一次報道了

2、在蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū)域的兩個半胱氨酸之間的疏水結(jié)合提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。本論文通過定向進(jìn)化和定點(diǎn)突變鑒定了來源于Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶C(XynC)內(nèi)部疏水核心的一個點(diǎn)突變(G201C),該點(diǎn)突變導(dǎo)致該突變體的熱穩(wěn)定性明顯提高,同時酶的比活也顯著提高。在該突變體中,201位和50位的半胱氨酸所形成的疏水結(jié)合是導(dǎo)致熱穩(wěn)定性提高的主要原因。突變體的SDS-PAGE和自由巰基的測定均表明50,201位的

3、半胱氨酸之間并不形成二硫鍵。這表明半胱氨酸不但可以通過形成二硫鍵,還能通過其本身的強(qiáng)疏水性質(zhì)提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在50和201位點(diǎn)上為半胱氨酸的G201C和C60A-G201C兩個突變體比本研究中其余的木聚糖酶突變體的熱穩(wěn)定性都要高。通過圓二色光譜分析,G201C的Tm值比野生型提高了9度,C60A-G201C提高了12度。經(jīng)過酶活測定,G201C和C60A-G201C在所有的溫度和pH值所測定的比活都要比野生型高,在72度,C60A-

4、G20lC的酶活是野生型的6倍。這表示C60A-G201C突變體酶在工業(yè)應(yīng)用中具有比野生型更加廣闊的應(yīng)用前景。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們可以通過改變蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸的疏水性從而改變蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,為后來的蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)提供新的思路和方向。
　　 另一方面,一些外界因素同樣有可能導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性發(fā)生變化,在這些外界因素中,底物一直被認(rèn)為能夠通過穩(wěn)定酶的活性中心而使酶在高溫下穩(wěn)定。雖然底物對酶的熱穩(wěn)定作用是被報道得較多的,但通過點(diǎn)突變提高

5、底物對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定作用卻很少被報道。本研究中,我們將XynC活性中心的57位的Asp突變?yōu)锳sn。在底物不存在的情況下,XynC和D57N突變體的熱穩(wěn)定性是相同的;但是在底物存在的情況下,底物卻能更好的穩(wěn)定D57N突變體,使其表現(xiàn)出比野生型更高的熱穩(wěn)定性。突變體中的Ash57,Giu202與底物分子之間可能存在的氫鍵導(dǎo)致底物能更好的穩(wěn)定突變體。該結(jié)果表明,酶在底物存在時的熱穩(wěn)定性同樣可以改造的,這就為以后通過定向進(jìn)化或理論設(shè)計(jì)提高工業(yè)