提高11家族木聚糖酶嗜堿性的分子改造.pdf

1、木聚糖酶是降解植物半纖維素主要成分木聚糖的最關鍵的酶，廣泛應用在動物飼料、食品、造紙、生物能源等工業(yè)。木聚糖酶應用在紙漿漂白工藝中可以減少有毒化學漂白劑的使用量，進而減少后序漂白廢水的毒性和減輕對環(huán)境的污染。其中11家族木聚糖酶由于分子量小且無纖維素酶活性，很適合應用于紙漿漂白工藝中。在紙漿漂白過程中紙漿多處于高溫堿性的環(huán)境下，為減少能耗和簡化工藝流程，需要選用嗜堿耐高溫的木聚糖酶。但是從自然界中分離到的野生型11家族木聚糖酶大多數(shù)是中

2、性酶，嗜堿木聚糖酶數(shù)量十分有限。因此需要對現(xiàn)有的野生型11家族木聚糖酶進行分子改造來得到嗜堿性提高的木聚糖酶突變體。本研究以11家族木聚糖酶xyn11A-LC為基礎，利用GeneMorph II Random Mutagenesis kit隨機突變木聚糖酶xyn11A-LC基因建立突變文庫，從中篩選出嗜堿性提高的木聚糖酶突變體。主要研究成果如下：
　　1.利用GeneMorph II Random Mutagenesis kit隨

3、機突變木聚糖酶xyn11A-LC基因，建立了包含有5000多克隆的突變文庫。
　　2.通過對構建的突變文庫進行篩選，最終篩選出嗜堿性明顯提高的突變體M52-C10。突變體M52-C10的最適pH與野生型的相比提高了0.5個單位，達到pH8.0，在pH8.5-pH10.0與野生型的相比提高了大約10-15％的相對酶活，最適溫度為55℃，有較好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
　　3.對突變體M52-C10的測序結果分析顯示出突變體M

4、52-C10含有兩個位點氨基酸的突變，分別是 E135 V和 V116 A。經(jīng)過驗證 E135 V對突變體M52-C10的嗜堿性提高起到主要作用。E135 V的最適p H比野生型的提高了0.5個單位，為p H8.0，在pH8.5-p H10.0與野生型的相比提高了10-20%的相對酶活，最適溫度為55℃，有較好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
　　4.對E135位分別進行定點突變得到E135K和E135R。E135K的最適p H比野生型

5、的提高了0.5個單位，為p H8.0，在p H8.5- p H10.0與野生型的相比提高了10-19%的相對酶活；E135 R的最適p H與野生型的相比提高了0.5個單位，達到p H8.0，在pH8.5-p H10.0與野生型的相比提高了大約15-25%的相對酶活，最適溫度為55℃，有較好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
　　5.總共得到比野生型木聚糖酶xyn11 A-LC嗜堿性明顯提高的三種突變體：E135 V、E135K和E135