成團(tuán)泛菌甘露聚糖酶的體外定向進(jìn)化.pdf

1、繼蛋白酶后，纖維素酶和半纖維素酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)中。其中，β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)可以水解以甘露糖為主鏈的半纖維素，徹底水解還需要β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和乙酰甘露聚糖酯酶(EC3.1.1.6)的協(xié)同作用。β-甘露聚糖酶來源廣泛，普遍存在于微生物和動(dòng)植物中。其應(yīng)用廣泛，在食品加工、咖啡提取、生物乙醇、制藥和造紙等領(lǐng)域中都有重要作用。

2、
　　 本實(shí)驗(yàn)研究的β-甘露聚糖酶(Man26P)，是從深海成團(tuán)泛菌（Pantoeaagglomerans）中篩選得到的屬于糖苷水解酶第26家族的酶。該基因(GenBankaccession no.FJ648764)有1047個(gè)堿基，編碼348個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量大約38.51 kDa，對(duì)底物槐豆膠的親和力Km值為5.78 mg/mL，催化效率（kcat/Km）為106.65 mL/mg·s，最適溫度為55℃，最適pH為6.0，在

3、30～70℃、pH4.0～8.0條件下酶學(xué)性質(zhì)良好且穩(wěn)定。為了獲得酶學(xué)性狀更優(yōu)良的菌株，并且為了更深入的理解蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，利用無引物PCR中添加200μmol/L Mn2+的DNA shuffling技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)Man26P進(jìn)行改造。
　　 DNA shuffling文庫(kù)的篩選結(jié)合了剛果紅平板顯色法和基于96孔板的高通量篩選法。從該突變文庫(kù)中篩選19，700個(gè)克隆子，獲得突變子G267S和H134R/F141

4、L。與野生型甘露聚糖酶Man26P相比，G267S和H134R/F141L對(duì)底物槐豆膠的Km值分別降低3.78倍和2.77倍，催化效率(kcat/Km)分別提高1.14和3.30倍。而后通過定點(diǎn)突變技術(shù)，更多的突變氨基酸被引入到第134位點(diǎn)。這其中與Man26P相比，H134R和H134K對(duì)底物槐豆膠的Km值分別降低2.32和1.56倍，催化效率(kcat/Km)分別提高2.81和2.75倍。并且發(fā)現(xiàn)隨著第134位點(diǎn)上突變氨基酸殘基側(cè)鏈

5、pKa值的增大，突變子對(duì)底物槐豆膠的Km減小，這可能是因?yàn)闃O性作用和正電荷作用增強(qiáng)導(dǎo)致的。除此，結(jié)合分子模擬分析揭示出第267位點(diǎn)上氨基酸殘基的性質(zhì)會(huì)影響酶對(duì)底物的親和力和酶釋放底物的速度。
　　 考慮到突變菌株酶活力的提高和突變氨基酸結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)等因素，選擇H134K和G267S進(jìn)一步研究溫度和pH對(duì)突變子酶活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H134K和G267S的最適溫度分別是55℃和50℃。與Man26P相比，H134K和G267S在60