新型啟動子PQ介導高溫α-淀粉酶表達的研究.pdf

1、高溫α-淀粉酶(BLA)是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，廣泛應用于釀造、食品加工、酒精等工業(yè)。實現BLA的高效制備對進一步提升其工業(yè)應用價值具有重要意義。本研究前期工作中，已圍繞BLA編碼基因克隆與功能鑒定、BLA高效表達載體及宿主細胞等進行了較深入的研究。本研究對一種全新的啟動子PQ介導BLA的表達進行了研究，分別在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中研究和鑒定了新型芽孢桿菌啟動子PQ的功能，證實了啟動子PQ在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿

2、菌中具有高效介導BLA表達的能力。主要研究內容如下：
　　 ⑴首先以B.licheniformis B0204染色體DNA為模板PCR擴增獲得含信號肽序列的BLA編碼基因(amyL)，克隆入載體pLakr中，構建成重組質粒pLa-amyL，再在amyL基因的上游插入人工合成的啟動子PQ，獲得重組質粒pLa-Gm-PQ-amyL。在重組大腸桿菌中，amyL基因能夠在啟動子PQ的介導下成功表達，重組菌表達的高溫α-淀粉酶的酶活力大小

3、為16.1 U/mL。表明啟動子PQ能在大腸桿菌中有效介導BLA的表達。
　　 ⑵比較研究了啟動子PQ在枯草芽孢桿菌中介導基因表達的能力。分別用啟動子PQ和啟動子P43構建了表達載體pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL，并轉化入枯草芽孢桿菌1A717(△amyA)中。重組枯草芽孢桿菌在淀粉平板上的水解淀粉能力差異顯著。重組菌進行搖瓶發(fā)酵105 h后，測定BLA酶活:B.subtilis(pUB-PQ-amyL)的最高

4、酶活為280 U/mL；B.subtilis(pUB-P43-amyL)的最高酶活為191 U/mL。實驗表明在枯草芽孢桿菌中啟動子PQ轉錄強度優(yōu)于已鑒定的強啟動子P43，由啟動子PQ介導的BLA最高表達水平是啟動子P43介導的最高表達水平的1.47倍。表明啟動子PQ能夠更高強度的介導BLA在枯草芽孢桿菌中的表達。
　　 ⑶將pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL轉化入地衣芽孢桿菌CBB D302，獲得重組菌后進行搖瓶