豬α-干擾素及其刺激因子Mx2抗豬瘟病毒的初步研究.pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever, CSF)是豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種急性、高度接觸性傳染病。在臨床上，由強毒引起、發(fā)病率乖死亡率均較高的稱為急性豬瘟，而弱毒感染引起的豬瘟由于不表現(xiàn)臨診癥狀則可能不易被察覺。豬瘟呈世界性分布，一旦暴發(fā)，會對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，所以WHO將其列入法定的A類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。
　　豬瘟病毒的基因組是單股正鏈線狀RNA，全長大小約為12.3kb。其5'端無

2、甲基化帽子結(jié)構(gòu)，但有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，還有多個不能啟動翻譯蛋白的隱形AUG密碼子存在，3'端沒有poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，在所有的瘟病毒屬中，3’端的保守性很高，尤其是最后大約100nt的區(qū)域內(nèi)。
　　α-干擾素之所以能夠發(fā)揮其抗病毒作用，是因為它能夠與其在效應細胞膜上的受體結(jié)合，內(nèi)化后進入細胞，誘導效應細胞合成某些具有活性的蛋白質(zhì)。Ⅰ型干擾素是細胞免疫抵御病毒病原體的第一道防線，其信號傳導的結(jié)果就是干擾素刺激基因(ISGs)被廣泛上

3、調(diào)，來靶向阻擊病毒生命周期的不同階段:入胞、復制、裝配和釋放。
　　Mx蛋白是是Ⅰ型干擾素(α/β)和Ⅲ型干擾素（γ）刺激后產(chǎn)生的細胞抗病毒感染的關鍵調(diào)節(jié)因子。它們屬于大GTP酶的動態(tài)蛋白超家族，這個家族與細胞內(nèi)囊泡的運輸和細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關。Mx蛋白具有廣泛的抗RNA病毒的活性，其抗病毒機理是病毒被抑制在其生命周期的早期階段:進入宿主細胞后、基因組開始復制前這一時期。
　　自從被發(fā)現(xiàn)有抗病毒作用后，Mx蛋白就開始被廣泛研

4、究，目前已成為抗病毒研究的熱點。到目前為止，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人MxB蛋白能抑制HIV-1的增殖、人MxA蛋白和豬Mx1蛋白能抑制CSFV的增殖、豬Mx2蛋白能抑制VSV和流感病毒的增殖等。本研究圍繞著豬Mx2蛋白對CSFV的作用開展了以下試驗:
　　1.干擾素α抗豬瘟病毒研究
　　本部分研究探討了干擾素α對豬瘟病毒的抑制作用的濃度依賴性和時間依賴性。結(jié)果顯示，用10、50、100和300ng/mL濃度的干擾素α處理豬腎細胞(P

5、K-15)，隨著干擾素處理濃度的升高，抑制豬瘟病毒的效果越明顯，相對于空白對照組的抑制率分別為40％、67％、83％和91％。而使用濃度為300ng/mL干擾素α處理PK-15細胞后，在24h時抑制CSFV效果最明顯，抑制率達到95％。另外，本試驗在PK-15細胞受到干擾素α刺激后，細胞內(nèi)Mx2的變化情況進行了探究。結(jié)果顯示，刺激細胞的干擾素α濃度越高，Mx2上調(diào)變化越明顯，并且其變化在24h之內(nèi)呈現(xiàn)時間依賴性。
　　2.豬Mx2

6、抗豬瘟病毒的初步研究
　　根據(jù)豬Mx2基因序列設計了兩對特異性引物，通過RT-PCR從豬IFN-α刺激的PK-15細胞中擴增了Mx2的前半段(1170bp)和完整的全長(2136bp)兩個目的片段，經(jīng)過酶切和測定序列后，分別克隆到真核表達載體pFLAG(1170bp)和pEGFP-C1(2136bp)中，成功構(gòu)建了兩個重組質(zhì)粒pFLAG-Mx2和pEGFP-Mx2，并且經(jīng)過Westernblot試驗驗證，兩個重組質(zhì)粒均能在細胞中正

7、確表達，蛋白大小分別為48KDa和102KDa，進一步激光共聚焦試驗驗證，兩個重組質(zhì)粒的亞細胞定位都是在細胞質(zhì)中。進一步研究了豬Mx2蛋白對豬瘟病毒的抑制作用。將重組質(zhì)粒pFLAG-Mx2和pEGFP-Mx2瞬時轉(zhuǎn)染到PK-15細胞中，實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，pFLAG-Mx2和pEGFP-Mx2都能抑制豬瘟病毒的增殖，抑制效率分別為56％和67％，呈現(xiàn)劑量依賴性，均在CSFV接種后的12-24h期間抑制作用逐漸增強。間接免疫

8、熒光試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pFLAG-Mx2的細胞孔中代表CSFV的綠色熒光斑數(shù)量要明顯少于轉(zhuǎn)染空載體pFLAG的細胞孔，說明重組質(zhì)粒pFLAG-Mx2在細胞中表達的Mx2蛋白對CSFV有抑制作用。激光共聚焦試驗結(jié)果表明，質(zhì)粒pEGFP-Mx2在細胞中表達的Mx2蛋白能抑制CSFV的增殖，但是抑制作用不是通過其與CSFV囊膜糖蛋白E2的相互作用來實現(xiàn)的。
　　3.豬瘟病毒Core蛋白的原核表達、抗體制備及應用
　　根據(jù)豬瘟病

9、毒衣殼蛋白(Core)基因序列設計一對特異性引物，RT-PCR從豬瘟兔化弱毒中擴增出完整的Core基因，經(jīng)酶切和序列測定后，克隆到攜帶His標簽的原核表達載體pColdI中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCold-Core，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosseta2(R2)中，利用IPTG誘導表達目的蛋白并鑒定表達效果。結(jié)果表明:經(jīng)終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導24h后，Core基因在R2中獲得分泌性可溶表達，表達量占菌體蛋白的32.6％，S