豬源Mxl蛋白的表達(dá)及其抗豬瘟病毒感染的研究.pdf

1、Mx(Myxovirus resistance)是一種由Ⅰ型干擾素(IFNα/β)誘導(dǎo)的具有GTP酶活性的抗病毒蛋白，具有廣譜抗病毒活性。對(duì)Mx蛋白多種多樣抗病毒活性機(jī)制研究非常重要。作為Mx蛋白家族的一員，豬Mx1蛋白已經(jīng)被證實(shí)對(duì)流感病毒和水皰性口炎病毒有強(qiáng)大的抗病毒能力，但目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道對(duì)豬瘟病毒的抗病毒研究。豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染性疾病，被國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)列為必須通報(bào)的傳染病之一。

2、
　　 本文對(duì)豬Mx1蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)和真核表達(dá)，制備鼠抗多克隆抗體，在細(xì)胞上研究豬Mx1蛋白的抗病毒活性。
　　 1.豬源Mx1基因的原核表達(dá)、鑒定及抗血清制備
　　 本研究通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，從pT-poMx1中擴(kuò)增出Mx1基因開放式閱讀框(1992bp)，并將其編碼區(qū)插入到攜帶GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體PGEX-6p-1中，經(jīng)酶切和序列測(cè)定后，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PGEX-poMx1;將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21

3、(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白并分析表達(dá)效果。結(jié)果表明:經(jīng)終濃度為0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)后4h，poMx1基因在BL21(DE3)中獲得高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白的32.6％，SDS-PAGE顯示融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為99KDa。將目的蛋白切膠后免疫Balb/c小鼠，制備了特異性多抗血清，Western blot結(jié)果顯示該抗血清與融合蛋白孵育反應(yīng)后有明顯的特異性條帶，該研究為poMx1蛋白抗病毒的效果鑒定和機(jī)制研究奠定了

4、基礎(chǔ)。
　　 2.豬源Mx1蛋白的原核表達(dá)、純化及抗病毒活性初步研究
　　 通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增出poMx1全長(zhǎng)基因并與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)基因串聯(lián)。將PTD-poMx1克隆至原核表達(dá)載體pCold-Ⅰ。鑒定正確的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2并在0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量為74.2KDa。融合蛋白經(jīng)過(guò)純化、變性、透析復(fù)性和濃

5、縮后進(jìn)行入胞試驗(yàn)，Western blot結(jié)果表明80μg/ml PTD-poMx1與Vero細(xì)胞孵育6h后能明顯檢測(cè)到融合蛋白成功轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。
　　 Vero細(xì)胞感染100TCID50VSV后進(jìn)行噬斑減少試驗(yàn)，160μg/mL、80μg/mL和20μg/mL PTD-poMx1蛋白處理組VSV滴度Log(PFU/mL)分別為8.05、8.10和8.31，而沒(méi)有用融合蛋白處理的對(duì)照組VSV滴度Log(PFU/mL)是8.55。

6、表明在PTD-poMx1蛋白的存在下，VSV在Vero上的增殖受到了抑制，抑制作用隨著處理蛋白的濃度增加而增強(qiáng)，而160μg/mL組和80μg/mL組相比抑制作用增強(qiáng)幅度不大，所以選擇80μg/mL作為融合蛋白抑制病毒復(fù)制試驗(yàn)的處理濃度。VSV接種Vero細(xì)胞檢測(cè)其TCID50,發(fā)現(xiàn)80μg/mL組VSV TCID50下降了101.1。SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測(cè)VSV在Vero細(xì)胞上增殖的mRNA水平，VSV

7、感染24h、48和72h后，對(duì)照Vero細(xì)胞中增殖的病毒分別是融合蛋白處理組增殖病毒的43.1倍、9.4倍和4.1倍。一系列結(jié)果均表明轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入Vero細(xì)胞的PTD-poMx1融合蛋白發(fā)揮了抗病毒效果。
　　 PK-15細(xì)胞感染豬瘟病毒石門株，用間接免疫熒光法測(cè)定病毒TCID50，發(fā)現(xiàn)用80μg/mL PTD-poMx1蛋白處理后病毒滴度從104.2/mL下降到了103.6/mL。200TCID50感染PK-15細(xì)胞24h、48h

8、和72h后，對(duì)照組豬瘟病毒的mRNA水平分別是融合蛋白處理組的2.5倍、1.9倍和2.1倍。結(jié)果說(shuō)明PTD-poMx1蛋白的存在對(duì)豬瘟病毒的復(fù)制產(chǎn)生了抑制作用。
　　 3.穩(wěn)定表達(dá)豬源Mx1蛋白PK-15細(xì)胞系的建立及其抗豬瘟病毒的初步研究
　　 根據(jù)GenBank所收錄的poMx1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，從pT-poMx1亞克隆出目的基因片段，雙酶切純化后克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-

9、poMx1，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切和測(cè)序分析該重組質(zhì)粒;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞(PK-15)后，經(jīng)G418抗性篩選，通過(guò)RT-PCR、Western blot和熒光觀察，鑒定表達(dá)的融合蛋白;結(jié)果表明:建立了能穩(wěn)定表達(dá)poMx1蛋白的PK-15細(xì)胞系(PK-15/EGFP-poMx1)，RT-PCR能夠檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的EGFP-poMx1 mRNA、Westernblot鑒定到99KDa的融合蛋白，直接熒光觀察到融合蛋白主要在胞漿中呈現(xiàn)顆粒性表達(dá)

10、。將豬瘟病毒石門株接種建立的細(xì)胞系PK-15/EGFP-poMx1后，TCID50測(cè)定、間接免疫熒光和SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明:與對(duì)照組PK-15相比，細(xì)胞系感染豬瘟病毒24h、48h和72h后的收獲的上清病毒液滴度都有所下降，隨著時(shí)間的增加下降幅度有所減小;細(xì)胞系中病毒熒光斑明顯減少，病毒mRNA水平明顯降低。說(shuō)明在PK-15細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)的融合蛋白EGFP-poMx1能夠抑制豬瘟病毒的復(fù)制，降