假型豬溫病毒體系構建及衣殼蛋白靶向滅活策略抗豬瘟病毒感染研究.pdf

1、南京農業(yè)大學博士學位論文假型豬溫病毒體系構建及衣殼蛋白靶向滅活策略抗豬瘟病毒感染研究姓名：周斌申請學位級別：博士專業(yè)：生物技術指導教師：陳溥言201006假型豬瘟病毒體系構建及農殼蛋白靶向滅活策略抗豬瘟病毒感染研究核表達載體pcDNA30，構建了重組真核表達質粒pcDNAE0，pcDNAE2和pcDNAE012將此3個質粒經(jīng)大量提取并純化后，經(jīng)磷酸鈣轉染人胚腎細胞(293T)采用兔抗豬瘟高免血清為一抗，F(xiàn)ITCSPA為二抗，分別應用流式

2、細胞術(FACS)和免疫轉印(Westernblot)鑒定真核質粒在293T細胞中的表達。結果表明3個質粒均可在293T細胞中表達，Westernblot檢測分析到了257、415弄P90kDa的3個條帶，F(xiàn)ACS檢測到熒光細胞比例分別為602％、552％和565％說明囊膜糖蛋白EO、E2和E012均能表達在細胞膜上，為后續(xù)假病毒顆粒的形成奠定了基礎2構建整合囊膜糖蛋白的假型豬瘟病毒體系及其鑒定將上述已經(jīng)鑒定的重組真核表達質瘩3pcDN

3、AE0，pcDNAE2和pcDNAE012分別與MuLv49型病毒構建體系的兩種骨架載體pHIT60(括MuLV的結構蛋白基因，屠Pgag和p01)和pHITlll(為MuLv的基因組，還包括一個報告基因腸c西經(jīng)磷酸鈣瞬時共轉染293T細胞，48h后收集假病毒上清，超速離心后純化假病毒顆粒用抗CSFV的多抗為一抗，通過Westernblot證明了整個囊膜糖蛋白E012能夠在假病毒顆粒表面表達，說明E012能夠整合至1]MuLv病毒粒子表

4、面，該假型豬瘟病毒感染SK6、PK15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8種細胞，48h后檢測發(fā)現(xiàn)只有在豬源細胞SK6、PK15和STtt，標記基因三口cz能有效表達，表明所構建的假病毒具有感染性，但只能夠感染豬源細胞因此通過該假型豬瘟病毒進一步證實了豬瘟病毒對豬的單一嗜性另外，純化后的病毒經(jīng)ReedMuench計算其TCID50為10458。加入各種濃度的NH4CI(030mmoVL)預先處理PK15細胞，37

5、“Cig育1h，而后加AMuLVE012作用，48l詬，拗JLacZ表達量；同時i殳pH依賴性的MuLVVSVG為陽性對照實驗結果表明MuLⅣE012感染性與NH4Cl濃度存在極顯著的線性負相關性，即隨著pH值的升高，假型病毒MuLVE012對PK15細胞感染能力逐漸降低，而當NH4CI濃度達至130mmol／L時MuLVE012進入宿主細胞幾乎被完全抑制因此通過假型豬瘟病毒證實了豬瘟病毒侵入細胞是受NpH影響的，即是pH值依賴型囊膜病

6、毒為避免操作活的病毒帶來的搞危險性，本研究利用假型豬瘟病毒建立了微量中和試驗標準陰PEl生血清和倍比稀釋的待檢血清56℃滅活30lIlin后，對每份血清進行2倍梯度稀釋，分別與假病毒MuLⅣE012按1：1混合，4℃過夜分別取100ItL上述病毒血清混合物一式3份加到96孔板PKl5細胞中，建立了微量中和試驗，與全病毒微量中和試驗進行了比較，實驗結果表明所建立的方法能夠代替全病毒進行血清中和抗體滴度的測定，能夠檢測臨床血清的豬瘟抗體中和