豬瘟病毒囊膜蛋白E0基因的表達及鼠抗E0多抗血清的制備.pdf

1、豬瘟(Hog cholcra,HC或Swine Fever，SF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的豬的一種以高熱稽留、小血管變性引起出血、梗死、壞死和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。 根據(jù)Genbank發(fā)表的豬瘟病毒CSFV HCLV-GD株E0序列，設(shè)計并合成引物，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)擴增CSFV兔化弱毒疫苗株C株的囊膜基因E0，結(jié)果獲得大小約為700bp的片段

2、。將該片段克隆到PGEM-T-easy載體上進行序列測定，與標準株序列同源性為99.9％。 從PGEM-T-E0重組質(zhì)粒中用BamHI和XhoI雙酶切獲得測序正確的EO基因片段，克隆入pET32a(+)中，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。陽性菌酶切鑒定正確后，按1:100比例接種2mLLB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，再以1:100比例接種2mL 2×YT液體培養(yǎng)基，37℃ 200rpm搖4 h后，加1.0mM IPTG；37℃誘導5 h后，終

3、止培養(yǎng)，將菌體蛋白超聲波裂解處理后進行SDS-PAGE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EO能夠得到高效表達，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。降低溫度誘導表達的結(jié)果表明，當25℃誘導時表達產(chǎn)物呈可溶性。Westen-blot分析結(jié)果證明，該表達產(chǎn)物具有反應(yīng)原性。 將E0基因片段與桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacl連接，篩選出重組轉(zhuǎn)座載體pFastBael-E0，轉(zhuǎn)座含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞后，獲得重組穿梭質(zhì)粒rBacmid