豬瘟地方流行株（BJCY-96）的全長(zhǎng)ORF測(cè)序及E0基因的分段表達(dá).pdf

1、本研究試圖從分子生物學(xué)角度來(lái)揭示目前豬瘟仍頻繁發(fā)生的原因，為廣泛開(kāi)展CSFV分子流行病學(xué)的研究提供基礎(chǔ)資料，為CSF的防制提供科學(xué)依據(jù)和理論支持，為豬瘟診斷提供穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原及診斷方法。本論文由2部分構(gòu)成： 1．應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增了一株國(guó)內(nèi)地方流行的CSF野毒全長(zhǎng)ORF基因，對(duì)其進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定及氨基酸序列推導(dǎo)，同時(shí)將其與c株、Alfort株、HCLV株和SM株進(jìn)行了同源性比較及遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，地方流行野毒株與

2、c株，Alfort株，HCLV株，SM株核苷酸序列同源性分別為95．8％、97．9％、95．7％和99．7％；氨基酸同源性分別為97．4％、98．7％、97．5％和99．7％。本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)得序列與石門標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株核苷酸同源性很高，與我國(guó)使用的疫苗株(HCLV)核苷酸同源性和c株則同源性大大降低，說(shuō)明某些豬瘟病毒流行株的變異已經(jīng)開(kāi)始向遠(yuǎn)離疫苗株的方向變異，推測(cè)現(xiàn)行的豬瘟疫苗對(duì)某些地方流行株的保護(hù)作用可能已經(jīng)降低。 2．．應(yīng)用RT-P

3、CR技術(shù)對(duì)疫苗株(HCLV)、經(jīng)典強(qiáng)毒株石門毒株(SM)E0基因分段進(jìn)行擴(kuò)增，得到約198bp、238bp、343bp的基因片段。將這3個(gè)基因分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p一1中，經(jīng)酶切、PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析確證其正確插入到表達(dá)載體中，且閱讀框正確，從而構(gòu)建成重組表達(dá)載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中，用異丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳，Western-blotting分析表

4、達(dá)的蛋白。結(jié)果表明，E0基因幾個(gè)片段均可以在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為36kDa、38kDa、42kDa(載體GST分子質(zhì)量為29kDa、融合表達(dá))，與理論推測(cè)的蛋白分子量一致；在Western-blotting實(shí)驗(yàn)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至NC膜上，在加一抗時(shí)選用不同的血清(SM毒攻毒后采集的豬陽(yáng)性血清和HCLV株免疫后采集的血清)，進(jìn)行交叉免疫學(xué)反應(yīng)。表達(dá)產(chǎn)物pGEX-X、pG

5、EX-Y和pGEX-Z以SM株為模板；pGEX-E、pGEX-F和pGEX-G以HCLV株為模板。結(jié)果表明SM陽(yáng)性血清和HCLV陽(yáng)性血清對(duì)pGEX-Y和pGEX-F片段(317—398AA)表達(dá)蛋白都可以發(fā)生反應(yīng)。SM陽(yáng)性血清與pGEX-X和pGEX-E片段(268—323AA)、pGEX-Z和pGEX-G片段表達(dá)蛋白(雄S--494AA)均可發(fā)生發(fā)生反應(yīng)。而HCLV陽(yáng)性血清只與pGEX-E和pGEX-G發(fā)生反應(yīng)因?yàn)楸磉_(dá)的重組蛋白可被豬