人干擾素—β在生菜中的表達、鑒定和生物活性研究.pdf

1、隨著分子生物學和遺傳轉化技術的發(fā)展，利用轉基因植物生產人或動物基因工程藥物蛋白已成為植物基因工程的一個新興研究領域。與目前的細菌、酵母及哺乳動物細胞等傳統(tǒng)藥物蛋白生產系統(tǒng)相比，用轉基因植物生產基因工程藥物蛋白具有其獨特的優(yōu)勢：成本低，可以以農業(yè)化的規(guī)模生產昂貴的生化藥物；完整的真核細胞表達系統(tǒng)，使表達產物具有較好的生物活性；安全性好，無外源性病原污染；口服植物疫苗能誘導粘膜免疫反應，生產簡便、成本低廉，不需要冷藏和低溫運輸。但植物表達存

2、在表達量低、下游分離純化困難等嚴重問題，因此尋找新的轉基因植物受體，開發(fā)新的植物表達系統(tǒng)，成為植物生物反應器研究的重點。 本研究以葉用生菜(Lactuca sativa L．sp)為試驗材料，探討優(yōu)化生菜農桿菌真空滲透瞬時轉化方法和穩(wěn)定轉化組織培養(yǎng)體系，采用瞬時轉化方法將四種不同的干擾素一B基因轉入生菜中，研究生菜瞬時表達干擾素-β的水平和生物活性，獲得結果如下： 1．對生菜的瞬時表達方法進行了系統(tǒng)優(yōu)化，建立了適宜生菜高

3、效瞬時表達的轉化體系(200 μ mol/L乙酰丁香酮、0.80D<,600>菌液密度、真空處理30min、共培養(yǎng)6d)。以條件A<,1>B<,1>C<,1>D<,1>(0 μmol/L乙酰丁香酮、0.40D<,600>菌液密度、真空處理10min、共培養(yǎng)2d)為對照，應用結果表明：優(yōu)勢組合的GUS表達水平為21.39nmol·mg<'-1>·min<'-1>MU，比對照(1.3l nmol·mgl·min<'-1>MU)提高16.3倍

4、。結果表明該生菜瞬時表達體系可有效的提高外源基因的表達。 2．糖蛋白藥物干擾素-β在生菜葉片中成功表達為27kDa．的蛋白，推測為帶有植物特有糖基化形式的糖蛋白；抗病毒活性表明，該干擾素-β能抑制水泡性口膜炎病毒對人羊膜wish細胞的攻擊，這也是首次對農桿菌真空滲透瞬時表達來源的生化藥物進行生物活性檢測的報道。由于基因定點突變使第17位半胱氨酸改為絲氨酸(Cys-Set)，去除了Cysl7對正常二硫鍵(Cys31和Cys141)

5、的影響，使干擾素β的空間結構更穩(wěn)定，因此，突變型的干擾素表達量和活性高于原始型干擾素。四種干擾素一B(IFN,無信號肽的干擾素-β；sIFN有信號肽的干擾素-β：mIFN,無信號肽突變型的干擾素-β：smIFN,有信號肽突變型的干擾素-β)表達產物的活性分別為： 3.1×10<'4>IU/mL，5.8×10<'4>IU/mL，6.3×10<'4>IU/mL，9.8×10<'4>IU/mL；表達量也依次升高。表明：Cys17向Ser17的

6、改變及信號肽的添加有利于干擾素-β表達量和活性的提高，可以利用農桿菌介導的瞬時表達方法快速、大量、廉價的生產人源細胞因子、疫苗等生化藥物。 3．為探討干擾素-β在植物中的糖基化形式，構建含有糖基酶PNGase F的植物雙元表達載體pBl121-F將含有pBl121-F的農桿菌GV3101與含有pBl121-smIFN的農桿菌GV3101混合后，真空滲透轉化生菜葉片，以期利用PNGalSe F的酰胺內切酶作用將干擾素-β的糖鏈切除

7、，但通過Western檢測，沒有發(fā)現干擾素-β分子量的變化，可能是由于干擾素-β的表達量較低，不能檢測到：PNGase F的作用，也可能是由于植物糖基化結構中含有較多的α-1，3一巖藻糖，α-1，3-巖藻糖的位阻影響了PNGase F的酶切作用。 4．以三種不同基因型生菜(日本生菜，美國大葉速生，泰國生菜)的兩種外植體(10d齡的子葉和真葉)為材料，建立了適合多種基因型生菜組織培養(yǎng)和植株再生體系：MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/L

8、NAA和0.1-0.5mg/L 6-BA，為不同基因型生菜的最適不定芽誘導培養(yǎng)基；基因型不同，所要求的激素濃度配比也不同：日本生菜的高效不定芽誘導激素配比為0.1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA，美國大葉速生為0.3mg/L 6-BA and 0.1mg/L NAA，泰國生菜為0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；真葉的不定芽分化率顯著高于子葉的分化率。最適的生根培養(yǎng)基為添加0.1mg/L NAA的MS；生菜不定芽